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目的:在系统性筛选、评价、获得老年猕猴模型的基础上,利用老年多器官功能退变模型探究幼年骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)对老年猕猴胸腺组织结构及相关因子表达的影响。通过对胸腺组织转录组测序探究幼年BMSC对衰老猕猴胸腺萎缩的作用机制,探讨幼年BMSC延缓或逆转胸腺萎缩的可行性,为临床BMSC治疗与免疫系统衰老相关的胸腺退化提供理论依据。方法:1.衰老猕猴模型筛选:健康幼年雌性猕猴5只,平均年龄3周岁,体重2～3kg;老年雌性猕猴10只,平均年龄25周岁,体重4～5kg。2.BMSC的分离、培养及鉴定:无菌条件下利用骨髓穿刺术采集平均年龄3周岁健康幼年雌性猕猴的骨髓,通过差速贴壁法和传代培养法进行分离和纯化BMSC,通过4次传代扩增,获取BMSC。倒置相差显微镜下观察BMSC的形态和生长状况,流式细胞术检测CD29、CD34、CD90及CD105细胞表面抗原阳性表达比例,体外诱导BMSC分化为成脂肪、成骨样和成软骨样细胞,检测诱导分化能力。3.动物分组及BMSC移植治疗:将上述筛选模型随机进行分组,即幼年组5只(n=5)、老年组4只(n=4)和老年治疗组6只(n=6)。老年治疗组猕猴按照1×10~7cells/kg的剂量经股静脉移植BMSC,隔天一次,连续3次输注;幼年组和老年组猕猴同一时间输注等体积生理盐水。常规饲养,末次移植6个月后处死各组猕猴,进行取材。4.BMSC移植治疗的疗效评价方法:通过PET-CT对幼年组、老年治疗组治疗前、治疗3个月和治疗6个月时观察胸腺影像学的变化;在BMSC治疗6个月后,麻醉处死各组猕猴,采集胸腺组织,观察拍照;取各组猕猴胸腺进行称重,计算胸腺指数;采集一部分胸腺组织,4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,通过HE染色、Masson染色和免疫荧光染色,观察胸腺组织结构变化、胶原纤维沉积变化和胸腺皮质及髓质结构变化;流式细胞术检测老年治疗组猕猴外周血中T细胞亚群和调节性T细胞(Regulatory cells,Tregs)细胞输出水平变化;ELISA法分析老年治疗组猕猴外周血中猴胸腺素α和猴胸腺生成素II分泌水平。5.BMSC移植治疗的机制评价方法:通过免疫组织化学染色法分析衰老相关蛋白(P21、P53、Sirt1和Sirt3)及凋亡相关蛋白(Caspase3、Bax和Bcl-2)表达情况;Tunel染色观察各组猕猴胸腺细胞凋亡情况;采用二代测序技术,对猕猴胸腺组织进行转录组测序,利用生物信息学方法对测序数据进行分析,比较不同年龄间猕猴m RNA转录的差异,筛选出与衰老相关差异基因;通过3D PCA、聚类分析及轨迹分析,探究衰老相关基因在治疗前后的变化;利用生物信息学方法,筛选出治疗后出现差异变化的衰老相关基因,通过GO富集分析,观察其主要富集的通路。结果:1.通过对衰老猕猴评价与筛选,成功获得具有自然衰老猕猴模型,老年猕猴均具有衰老表型,毛色黯淡,活动度差,有明显脑萎缩、肺纤维化、胸腺和卵巢萎缩等典型特征。2.通过差速贴壁法获得BMSC,通过分离培养,BMSC在3～4d开始出现细胞生长,原代BMSC胞呈集落生长,当细胞融合率达80%～90%时进行扩增传代。第四代(P4)细胞形态均一,呈长梭形、成纤维细胞样,旋涡状生长。经分化能力检测,P4代BMSC成脂诱导分化培养后,油红O染色呈阳性;通过流式细胞术检测,发现CD29、CD34、CD90及CD105的阳性率分别为98%、0.99%、98.8%、99.8%,符合间充质干细胞的标准;成骨诱导分化培养后,茜素红染色呈阳性;成软骨诱导分化培养后,阿利新蓝染色呈阳性。3.BMSC移植治疗疗效评价:通过PET-CT观察,幼年组和老年组胸腺PET-CT显示胸腺位置正常,老年组治疗前胸腺大部分为脂肪组织所替代,仅见少量细纤维索条状结构,密度同脂肪组织,SUVmax<1;治疗后3个月、6个月胸腺组织密度逐渐增加,CT值逐渐增高,SUVmax>1;胸腺指数,老年组明显低于幼年(P<0.01),老年治疗组猕猴较老年组升高(P<0.05),老年治疗组较幼年组差异无显著性(P>0.05);HE染色胸腺全组织切片可见,幼年组猕猴胸腺完整;老年组猕猴胸腺萎缩,胸腺实质面积减少,萎缩面积达90%;老年治疗组猕猴不断向正常胸腺组织改变,胸腺实质面积达到30%以上;通过HE染色发现,幼年组可见胸腺组织结构和被膜较为完整,老年治疗组较老年组胸腺组织结构完整,胸腺实质面积增大,皮、髓质结构改善且开始出现界限,胸腺细胞增多,脂肪组织减少;通过Masson染色发现,幼年组胸腺纤维程度低,老年治疗组较老年组胶原纤维改善,胶原增生程度低于老年组,胸腺纤维化程度明显减轻;通过免疫荧光染色发现,老年治疗组逐渐出现皮质和髓质交界结构,胸腺结构致密,CK5、CK8老年治疗组表达较老年组明显增高(P<0.05);CK5+CK8老年治疗组CK5表达较老年组明显增高(P<0.05),CK8表达较老年组有上升趋势(P>0.05);通过对老年治疗组外周血中T细胞亚群检测发现,CD3~+T细胞在外周血中的百分比呈先升高后降低的趋势,治疗30天和60天较治疗前显著增加(P<0.05),治疗90天较治疗前降低(P>0.05);CD3~+CD4~+T细胞呈缓慢增长的趋势,治疗前较治疗30天、60天和90天差异无统计学意义(P>0.05);CD3~+CD8~+T细胞呈先升高后降低再升高的趋势,治疗30天、治疗60天和90天较治疗前无统计学意义(P>0.05);通过对老年治疗组猕猴外周血中Tregs检测发现,Tregs在外周血中的百分比在治疗后呈先下降后升高的趋势,其中治疗30天、治疗60天和治疗90天较治疗前均有有显著性意义(P<0.05);通过ELISA法分析老年治疗组猕猴外周血中猴胸腺素α和猴胸腺生成素II分泌水平发现,胸腺素α分泌水平在BMSC输注后呈先升高后降低的趋势,其中治疗30天较治疗前明显增加(P<0.01),治疗60天和治疗90天较治疗前增加(P>0.05);猴胸腺生成素Ⅱ分泌水平呈先升高后降低的趋势,在治疗后30天和60天较治疗前呈增长趋势,治疗90天呈下降趋势(P>0.05)。4.BMSC移植治疗机制评价:通过免疫组织化学染色法发现,衰老相关蛋白P21表达老年治疗组明显较老年组降低(P<0.05),P53表达老年治疗组明显较老年组降低(P<0.05),Sirt1表达老年治疗组较老年组升高(P>0.05),Sirt3表达老年治疗组较老年组有升高趋势(P>0.05);凋亡相关蛋白Caspase3与Bax基因表达老年组较老年治疗组升高(P<0.01),Bcl-2表达老年组较老年治疗组降低(P<0.05);通过对胸腺组织中m RNA转录组测序和生信分析,发现组织转录组表达特征相比老年组有趋向于年轻猕猴胸腺表达特征的倾向,共检测到在与胸腺组织衰老相关的差异表达基因共312项,其中随年龄增加上调基因305项,随年龄增加下调基因7项;3D PCA分析发现,发现老年治疗组相比老年组整体转录组特征具有非常明显的倾向青年组方向的趋势;聚类分析和轨迹分析发现BMSC移植后胸腺表达特征更趋向于青年组猕猴胸腺表达特征。通过GO富集分析,发现随衰老上调而治疗后下降基因主要富集在细胞因子和细胞因子受体相互作用、肾小管形成、突触信号传送、离子运输正向调节、破骨细胞分化调节等通路上。结论:1.确定了有效的自然衰老猕猴胸腺功能重建的评价方法;2.建立猕猴BMSC的制备方法,获取细胞形态、生长特性、细胞表面抗原和分化潜能均符合标准的BMSC;3.幼年猕猴BMSC移植可促进衰老猕猴胸腺结构的重建,改善T细胞输出能力及胸腺激素生成功能。4.幼年猕猴BMSC移植调节衰老和凋亡相关基因,改善胸腺退变。