[研究背景和目的]我国肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）有超过80%的病例是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）导致,目前,乙肝病毒的致癌机制仍不完全清楚。HBV编码的X蛋白（Hepatitis B virus X proterin,HBx）不仅是调控乙肝病毒转录复制的关键转录因子,也是HBV致癌的最重要效应因子,已有研究证实,HBx可促进HCC的增殖、转移、侵袭等恶性行为。HBx蛋白参与了宿主细胞众多表观遗传学调控机制来影响肝癌的发生发展。课题组最新研究发现,HBx蛋白可以上调并招募宿主细胞组蛋白甲基转移酶核心亚基（WD repeat domain 5,WDR5）蛋白到染色质上,促进宿主细胞促癌基因和乙肝cccDNA的组蛋白 H3 第 4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）表观修饰（即“HBx-WDR5-H3K4me3”作用轴线）。然而,WDR5并没有催化H3K4me3的作用,需要由组蛋白甲基修饰酶KMT2s家族成员催化完成,目前,尚不清楚HBV所致肝癌中哪一个组蛋白甲基转移酶参与了 HBx-WDR5介导的H3K4me3修饰。并且,在HBV所致肝细胞癌中,HBx通过上调并募集WDR5从而上调何种靶基因的H3K4me3修饰来促进肝癌细胞增殖的具体机制也有待进一步研究。通过进一步分析课题组前期研究结果数据,发现HBx、WDR5共同结合在ALKBH5和FTO基因启动子区,并且H3K4me3在ALKBH5和FTO基因启动子区富集。ALKBH5和FTO是催化mRNA去N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰酶,现有研究证实它们两者的表达与肿瘤细胞增殖密切相关。这些结果提示我们:HBV所致肝细胞癌中“HBx-WDR5-H3K4me3”作用轴线可能通过调控ALKBH5和FTO表达影响RNA m6A修饰,进而促进肝癌发生发展。m6A修饰广泛存在RNA中,并且调控了 mRNA的稳定性、核浆转运、剪切和翻译等过程。多篇文献证实m6A修饰以及调控m6A修饰的甲基化酶Writers,Erasers和Readers参与了肝癌的发生发展,目前对去m6A修饰酶ALKBH5和FTO在HBV所致HCC中的表达情况、肿瘤生物学功能和作用机制尚不清楚。此外,有文章报道所有的 HBV RNA 的 3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）含有 m6A修饰（包括HBxmRNA）,并介导了 HBV RNA的稳定性或其逆转录过程。那么,在肿瘤细胞中异常表达的ALKBH5和（或）FTO是否会调控HBV自身的RNA甲基化修饰,有待进一步研究。综上所述,我们拟将从表观遗传学组蛋白甲基化和RNA甲基化修饰两个角度入手,探讨RNA m6A去甲基化酶ALKBH5和FTO在HBV致癌中的作用,阐明“HBx-WDR5-H3K4me3”如何上调RNA m6A去甲基化酶,最后探究ALKBH5和（或）FTO是否通过m6A去修饰参与了 HBx mRNA的调控。研究调控m6A修饰酶在HBV致癌中的作用,有望为肝癌的发生发展揭示新机制、为肝癌的治疗提供新靶标。[方法]第一部分探讨mRNA m6A去甲基酶ALKBH5/FTO在中国乙肝病毒感染肝癌（HBV-HCC）中的作用。在肝癌细胞系中验证ALKBH5和FTO的蛋白表达情况;在9例乙肝肝癌临床标本中验证两个蛋白mRNA和蛋白的表达情况;通过79例乙肝肝癌组织免疫组化芯片进一步验证两个蛋白的表达和临床预后的影响;通过生物信息学方法对文献数据进行挖掘,分析ALKBH5/FTO在HBV所致肝癌中的表达以及和临床预后的相关性;通过CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤实验,研究HBV所致ALKBH5/FTO高表达的肿瘤生物学功能。第二部分探索HBV所致肝癌中哪一个组蛋白甲基转移酶参与了 HBx-WDR5介导的H3K4me3修饰从而上调ALKBH5和FTO。在肝癌细胞模型中,通过RT-qPCR 和 ChIP-qPCR 先验证“HBx-WDR5-H3K4me3”作用轴上调 ALKBH5和FTO;通过免疫沉淀后质谱分析,找到可能参与“HBx-WDR5-H3K4me3”作用轴线的辅助蛋白,结合文献找到与之作用的下游组蛋白甲基转移酶,并通过生物信息学方法对文献数据分析来进一步验证其可能性和相关性,最后用ChIP-qPCR进行验证。第三部分,验证肿瘤细胞中异常表达的ALKBH5和FTO是否也会调控HBV自身的RNA甲基化修饰。在肝癌细胞模型中,通过MeRIP-seq、MeRIP-qPCR证实ALKBH5和（或）FTO参与调控HBx mRNA m6A的去甲基化修饰作用;通过Actinomycin D转录抑制实验进一步验证ALKBH5和（或）FTO对HBx mRNA稳定性等的调控作用。[结果]1、HBV-HCC肝癌细胞系和肝癌组织中ALKBH5、FTO表达水平升高。检测4种人源肝癌细胞系,发现带有HBV感染的细胞中ALKBH5和FTO蛋白水平都显著上调;进一步在HBV体外感染模型中发现,HepG2-NTCP和PHH细胞其ALKBH5和FTO的蛋白水平在感染HBV病毒后升高;在新鲜HBV-HCC肝癌标本中,RT-qPCR和WB实验证实,ALKBH5、FTO mRNA和蛋白水平显著高于对应的癌旁标本;而IHC实验则明确了 ALKBH5、FTO蛋白主要在HBV-HCC的癌细胞核中高表达;进一步扩大HBV-HCC样本量,生物信息学提取了 159位患者FTO、ALKBH5 mRNA和蛋白水平,此外,还获取了 79例来自中国肝癌病人的组化芯片结果,大样本数据证实了 ALKBH5和FTO确实在肝癌中高表达。这部分结果明确了 ALKBH5和FTO在HBV-HCC中高表达。2、HBV-HCC中高表达的ALKBH5、FTO影响临床预后通过对多个临床队列中病人的ALKBH5、FTO表达高低进行生存分析,发现ALKBH5、FTO高表达的患者生存期显著缩短。因此,ALKBH5和FTO在HBV-HCC中的表达水平具有临床预后评价意义。3、ALKBH5、FTO促进肝癌细胞的增殖和转移能力通过CCK-8实验,我们证实了 ALKBH5、FTO可促进肝癌细胞的增殖,通过transwell肿瘤迁移实验证实了 ALKBH5、FTO能促进肝癌细胞转移。在裸鼠皮下移植ALKKBH5或FTO敲低的肝癌细胞后发现,敲低ALKBH5或FTO抑制了裸鼠肿瘤的形成能力、增殖速度和瘤体大小。这部分结果明确了 ALKBH5和FTO在HBV-HCC中的肿瘤生物学功能。4、“HBx-WDR5-H3K4me3”作用轴线上调 ALKBH5 和 FTO前一部分结果证实了 ALKBH5和FTO在HBV-HCC的肿瘤生物学功能,同时在HBx突变缺失的HBV体外感染模型中,HBx可能参与了对ALKBH5和FTO的表达调控。此外,HBx、WDR5的ChIP-seq结果提示,HBx、WDR5结合在ALKBH5和FTO的启动子区,并伴有H3K4me3修饰。临床组织中HBx、ALKBH5和FTO的表达水平也具有正相关。为进一步证实HBx对ALKBH5和FTO的直接调控作用,分别过表达HBx和敲低HBx,发现HBx可直接调控ALKBH5和FTO的表达;利用ChIP-qPCR技术,发现HBx确实结合在ALKBH5和FTO的启动子区,并且敲低HBx或WDR5后ALKBH5和FTO在基因启动子区H3K4me3的表达水平都下调。5、WDR82-KMT2G/F 在 HBV-HCC 中上调 ALKBH5/FTO 启动子区 H3K4me3 修饰前部分结果说明HBx可通过调控表观遗传学H3K4me3修饰调控ALKBH5和FTO的基因表达,随后,在HepG2细胞中过表达HBx后,通过蛋白免疫沉淀后进行质谱检测发现WDR5伙伴蛋白中高度富集了 WDR82;CoIP实验也证实WDR82和WDR5在同一蛋白复合体中;结合文献,WDR82是组蛋白修饰酶KMT2G/F的独特亚基蛋白,我们推测WDR82-KMT2G/F可能是HBx介导H3K4me3修饰的关键酶。ChIP-qPCR检测发现,敲低WDR82、KMT2G、KMT2F后,ALKBH5和FTO基因启动子区H3K4me3修饰水平下调。这说明WDR82-KMT2F/G确实参与了对ALKBH5和FTO的表观H3K4me3修饰。6、WDR5-WDR82-KMT2G/F 在 HBV-HCC 标本中与 ALKBH5/FTO 具有表达相关性为进一步探讨WDR82-KMT2G/F表观修饰酶在HBV-HCC组织中是否异常表达以及其与HBV-HCC预后的相关性,生物信息学挖掘分析了 159例HBV-HCC数据,对WDR5、WDR82、KMT2G/F的表达情况、预后情况进行分析,并比较了其和ALKBH5/FTO的表达相关性,提示WDR5、WDR82、KMT2G/F在HBV-HCC中高表达,与ALKBH5、FTO的表达水平具有相关性。7、MeRIP-seq证实HBV介导了广泛的宿主细胞m6A修饰为探讨ALKBH5和FTO在乙肝肝癌组织中的异常表达是否会影响HBV-HCC细胞 RNA 的 m6A 修饰,利用 MeRIP-seq 和 RNA-seq 检测了 HepG2 和 HepG2.2.15细胞中m6A修饰差异基因和表达差异基因。将表达差异和m6A修饰差异基因筛选出来取交集,进行Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG pathway分析,发现HBV的表达可能通过ALKBH5和FTO的异常表达介导了宿主细胞广泛的m6A修饰。8、HBxmRNA具有m6A修饰,并在肝癌中m6A修饰下调将HepG2.2.15细胞的MeRIP-seq数据比对到HBV基因组,发现HBV基因组上有三个m6A修饰峰,这三个m6A修饰峰内含有m6A修饰的GGAC基序,这提示HBV的RNA也存在m6A修饰;利用MeRIP-qPCR在过表达HBx-3’UTR质粒的HepG2细胞和临床肝癌组织中进一步证实HBx mRNA确实存在m6A修饰;检测临床肝癌组织和癌旁组织中HBxmRNA的m6A修饰情况,发现癌组织中HBx mRNA的m6A修饰程度显著低于癌旁组织。9、HBxmRNA的m6A修饰介导了其mRNA降解过程通过构建HBx 3’UTR区m6A修饰位点突变质粒,转染肝癌细胞系并加入Actinomycin D转录抑制剂,MeRIP-qPCR实验证实HBx mRNA的m6A修饰对于其mRNA的降解发挥关键调控作用。10、ALKBH5调控HBx mRNA的m6A修饰,进而调控其表达在HepG2过表达HBx 3’UTR野生型（WT）的细胞中分别敲低ALKBH5、FTO,MeRIP-qPCR 检测 HBx m6A 的变化。发现敲低 ALKBH5 后 HBx mRNA的m6A修饰显著上调,而敲低FTO未发现对HBx m6A有调控作用。[结论]综上所述,本研究的主要结论和意义是:1.ALKBH5和FTO在HBV所致肝癌中高表达,并和临床预后相关,在肝癌中发挥促进肿瘤细胞增殖和转移的功能。2.HBV病毒编码的HBx蛋白,劫持利用宿主细胞组蛋白甲基转移酶WDR5-WDR82-KMT2F/G复合体,促进mRNA去甲基化酶ALKBH5和FTO的基因启动子区的H3K4me3修饰,进而上调表达ALKBH5和FTO;而上调的ALKBH5和FTO作为RNA m6A去甲基化酶又广泛调控了宿主mRNA的m6A修饰,介导了一系列基因的表达或抑制;此外,HBxmRNA的3’UTR也存在m6A修饰,并受ALKBH5调控而非FTO调控;高表达的ALKBH5抑制了 HBx mRNA的m6A修饰水平,从而抑制了 HBx mRNA的降解,使HBx维持在高表达状态,形成了“HBx-ALKBH5-m6AHBx”正反馈环路。本研究报道了ALKBH5和FTO在慢乙肝所致肝癌中高表达,并且与临床预后相关。解析了 ALKBH5和FTO在慢乙肝所致肝癌中的上调分子机制,以及ALKBH5对下游HBx mRNA的m6A表观修饰的影响。提出了“HBx-ALKBH5-m6AHBx”正反馈环路在HBV所致肝癌中的重要作用。为慢乙肝所致肝癌防治补充了新的分子机制,引入了潜在靶标,提出了表观交叉调控假说。