【摘 要】
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目的:先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease,HSCR）是常见于婴幼儿中的因肠道缺失神经节细胞而引起的,一种先天性的消化道发育异常疾病。目前认为胚胎期肠神经脊细胞迁移、增殖、分化等发育障碍,引起消化道远端肠壁缺乏神经节细胞,是引发疾病的主要原因。多组学数据分析显示,前列腺素E2（PGE2）及其合成酶m PGES（Microsomal Prostaglandin E2Syntha
【基金项目】
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东南大学—南京医科大学合作研究重点项目；
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目的:先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease,HSCR）是常见于婴幼儿中的因肠道缺失神经节细胞而引起的,一种先天性的消化道发育异常疾病。目前认为胚胎期肠神经脊细胞迁移、增殖、分化等发育障碍,引起消化道远端肠壁缺乏神经节细胞,是引发疾病的主要原因。多组学数据分析显示,前列腺素E2（PGE2）及其合成酶m PGES（Microsomal Prostaglandin E2Synthase）在HSCR病变肠管中显著增高。鉴于PGE2通过其相关信号通路影响F-肌动蛋白（F-actin）的细胞骨架结构,进而抑制细胞的迁移运动,而PGE2合成酶m PGES又广泛表达于肠上皮细胞,因此我们推测PGE2水平异常可能参与HSCR发病机制。本研究的目的是利用HSCR动物模型,探索PGE2和先天性巨结肠发生之间的关系,明确PGE2生物合成途径是否可成为防治先天性巨结肠的潜在靶点。方法:1.靶向m PGES的siRNA（sim PGES）筛选:设计并筛选靶向m PGES基因的siRNA序列,体外转染小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）后,通过实时荧光定量PCR和蛋白Western blot检测转染后细胞m PGES的m RNA和蛋白表达变化,进而筛选出最有效的干扰片段。2.聚乙烯亚胺（PEI）与siRNA纳米复合物的制备与表征:为了确定合适的PEI与siRNA结合比例,将PEI与siRNA在不同N/P比混合,通过凝胶阻滞实验选择最佳结合比,后以最佳结合比制备复合物,通过动态粒度光散射检测复合物的表面Zeta电位和粒径大小。3.PEI/siRNA复合物在孕鼠体内的生物分布:按照最佳N/P比制备PEI与Cy5-siRNA复合物,以1mg siRNA/kg经孕鼠腹腔注射复合物,24小时后利用IVIS Spectrum成像系统观察荧光信号在消化道、肾脏、脾脏、肝脏、子宫及胎鼠等组织中的分布。4.sim PGES在体干扰效率分析:最佳N/P比条件下小鼠按1mg siRNA/kg腹腔注射PEI/sim PGES复合物,设PEI/si NC为对照。取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、直肠、结肠、盲肠组织,通过q PCR和Western blot分析组织中m PGES的表达,确定sim PGES在体干扰效率。5.HSCR小鼠模型的构建:利用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6J小鼠Endothelin receptor-B（Ednrb）基因,获得Ednrb+/-小鼠。Ednrb+/-雌雄鼠交配,获得Ednrb-/-小鼠。分析Ednrb-/-小鼠的症状、体征及消化道神经节细胞分布,明确HSCR小鼠建模是否成功。6.sim PGES对HSCR小鼠模型的在体疗效分析:孕鼠在E8.5和E12.5按1mg siRNA/kg腹腔注射PEI/sim PGES 606复合物,同时设PEI/si NC复合物为阴性对照。取si NC组新生幼鼠和sim PGES 606治疗组胎鼠,通过基因型鉴定挑选Ednrb-/-鼠,观察不同处理组Ednrb-/-鼠消化道表型,HE染色及免疫组化检测肠神经节细胞,以此评价复合物对HSCR疾病模型的治疗作用。结果:1.设计的6对siRNA筛选结果显示,sim PGES 606在体外对m PGES具有明显的抑制效果;2.腹腔注射的sim PGES 606在体内能有效抑制直结肠等组织中m PGES的m RNA和蛋白的表达,且PEI/siRNA复合物可透过胎盘屏障;3.PCR、DNA测序、Ednrb-/-小鼠表型鉴定及免疫组化分析确定了HSCR小鼠建模成功;实验获得了不同于文献报道的Ednrb基因片段敲除大小的小鼠模型,具有创新性;4.PEI/sim PGES 606复合物能改善Ednrb-/-小鼠结肠远端与直肠狭窄症状,增加Ednrb-/-小鼠结肠远端神经节细胞数量。至此初步证明靶向干扰前列腺素E2生物合成通路对先天性巨结肠小鼠具有一定的治疗作用。结论:1.获得了有效抑制小鼠mPGES的siRNA,PEI与siRNA在N/P=8时所形成的复合物能转运至肠上皮细胞发挥RNA干扰效应;2.PEI/siRNA经腹腔给药可有效转运至孕鼠宫内胚胎;3.成功构建了先天性巨结肠小鼠模型;4.抑制PGE2的生物合成能缓解HSCR小鼠消化道病变程度,增加肠道组织中神经节细胞的分布,对疾病有较好的治疗作用。
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