丁酸酯淀粉发酵产酸机制及对结肠炎的缓解作用研究

来源 :江南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:feixiang20090911
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丁酸是肠道菌群的核心代谢产物之一,也是肠道上皮细胞的主要能量来源。鉴于其在调节肠道稳态方面的诸多功效,外源丁酸补充途径的探索已成为近年来代缓解炎症性肠病(IBD)的研究热点。丁酸酯淀粉是一类特异性产丁酸的抗消化淀粉(RS),它能有效避免传统丁酸制剂存在的刺激性强、有腐臭气味、制备工艺复杂和结肠递送率低等缺陷,还可携带丁酰基基团和可发酵碳水化合物至结肠,这对改善炎症性肠道的丁酸产量不足和肠道菌群失调具有可观的应用价值。然而,目前有关丁酸酯淀粉的研究仍局限于一些疾病模型的应用效果评估,而未能明确阐述其与肠道菌群的互作关系和对肠道稳态的调控机制。因此,本论文基于体外模拟发酵体系,系统探究了丁酰基基团对丁酸酯淀粉特异性产丁酸与非特异性产丁酸途径的影响与机制,并结合体外模拟消化体系,详细考察了不同来源丁酸酯淀粉的体外模拟消化与发酵行为,最终基于小鼠结肠炎模型,深入探究了丁酸酯淀粉对结肠炎症的缓解效果及其参与炎症缓解的关键代谢途径,以期为肠道稳态化调控提供一种安全、有效的策略。主要研究内容和结果如下:首先,系统探究了丁酸酯淀粉的特异性产丁酸机制。体外模拟发酵结果显示,丁酸酯淀粉和异丁酸酯淀粉可分别产生较高含量的丁酸和异丁酸;而同样具有抗消化特性的异丁酸酯淀粉和异麦芽低聚糖均未能显著增加丁酸占比,说明丁酰基基团的代谢是决定丁酸酯淀粉产丁酸特异性的关键因素。为进一步明确丁酰基基团的代谢机制,采用羧酸酯酶试剂盒测定了发酵后菌体的羧酸酯酶活性,结果显示不同发酵样本中均能检测到较高的羧酸酯酶活性,并显著高于空白对照(BC)组,说明羧酸酯酶活性与菌体数量呈正相关,同时也证实了肠道菌群具备水解丁酸酯淀粉中丁酰基基团的能力。β-多样性分析结果显示丁酸酯淀粉组、异丁酸酯淀粉组和异麦芽低聚糖组的群落组成存在较高相似性,说明丁酸酯淀粉的RS属性是塑造肠道菌群组成的关键因素。KEGG代谢通路富集结果显示丁酸酯淀粉与异丁酸酯淀粉发酵均未能显著上调丁酸合成通路的相对丰度,但却改变了丁酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶通路与丁酸激酶通路的分配比,说明丁酸酯淀粉的RS属性仅可通过影响肠道菌群组成来改变其丁酸代谢途径。其次,选用丁酰基含量一致的A型丁酸酯普通玉米淀粉(BNMS)、A型丁酸酯蜡质玉米淀粉(BWMS)和B型丁酸酯马铃薯淀粉(BPS)为底物模型,重点探究了体外模拟发酵阶段丁酰基基团对丁酸酯淀粉非特异性产酸途径的影响。结果表明,丁酰基基团的水解是限速步骤,而分布在淀粉颗粒表面的丁酰基基团,显著迟缓了丁酸酯淀粉的发酵产酸速率;A型淀粉因具有特殊的通道结构,颗粒表面丁酰基基团占比显著低于B型淀粉,结合体外模拟发酵结果,发现丁酸酯淀粉的发酵产酸速率与其颗粒表面的丁酰基基团占比呈负相关。分离发酵菌体中的肠道微生物淀粉酶(GMA)并探究其对丁酸酯淀粉的水解行为,发现丁酰基基团可干扰GMA催化进程,从而降低丁酸酯淀粉发酵产酸速率。水解产物组成结果发现,丁酰基基团的存在显著提高了麦芽低聚糖G5-G7的生成量;结合体外发酵结果,推知丁酸酯淀粉发酵产丁酸能力与其初级降解产物中G5-G7相对含量存在紧密关联。再次选用丁酰基含量一致的A型BNMS、A型BWMS和B型BPS为研究对象,系统考察了颗粒态与糊化态淀粉从模拟小肠消化到模拟结肠发酵阶段的动态变化过程。Englyst体外消化实验结果表明,与原淀粉相比,颗粒态与糊化态丁酸酯淀粉中的RS比例均显著增加,而慢消化淀粉(SDS)比例未有显著改变;三种糊化态丁酸酯淀粉中的RS比例相近,而三种颗粒态丁酸酯淀粉中的RS比例差异显著。颗粒态淀粉的消化产物形貌观察发现,丁酰基化有助于维持淀粉被消化过程中的颗粒完整性。相较之下,BWMS颗粒的表面侵蚀程度最为严重,BNMS次之,BPS最轻。相对分子量分布结果表明,颗粒态丁酸酯淀粉消化产物中含有少量线性短链或麦芽低聚糖;而糊化态丁酸酯淀粉的消化产物主要由线性短链和麦芽低聚糖组成。体外模拟发酵结果表明,B型丁酸酯淀粉颗粒的侵蚀和破裂速率显著低于A型淀粉,并呈现出由外到内、分散点蚀及逐层剥落的单向降解模式;而A型淀粉则呈现由外到内或由内到外的双向降解模式。为验证基于丁酸酯淀粉的外源丁酸递送对结肠炎症的缓解效果,采用葡聚糖硫酸钠(DSS)构建结肠炎小鼠模型,系统考察了丁酸酯淀粉干预对结肠短链脂肪酸(SCFAs)分布、结肠炎症状变化、结肠病理、屏障功能和免疫调节的影响。结果显示,丁酸酯淀粉干预显著提高了结肠炎小鼠的肠道丁酸含量,并通过改善小鼠体重变化、疾病活动指数(DAI)、结肠长度、相对脾重、结肠病理、氧化应激水平、黏液层分布和紧密连接蛋白表达量,有效延缓了结肠炎发病进程。进一步分析发现,丁酸酯淀粉干预显著抑制了炎症标志物含量和促炎细胞因子表达水平的增加,并通过上调抗炎细胞因子基因的表达量,有效避免了炎症反应的加剧。此外,丁酸酯淀粉干预也显著缓解了肝脏氧化应激损伤和胆汁酸代谢紊乱,进而从侧面证明了丁酸酯淀粉对结肠炎症和屏障功能的改善效果。最后,选择丁酸酯高直链玉米淀粉(BHAMS)为研究对象,并以高直链玉米淀粉(HAMS)和三丁酸甘油酯(TB)为对照,探究了丁酸酯淀粉参与结肠炎症缓解的关键代谢途径。结果表明,TB对小鼠结肠炎症状、组织损伤、屏障功能和免疫应答的改善效果最好,BHAMS次之,HAMS最差,说明丁酸酯淀粉的丁酸载体属性在其缓解结肠炎症时起主导作用。对比结肠和回肠的干预效果后发现,随着BHAMS在肠道内的不断推进,其对炎症反应的调节能力逐渐增强,推知BHAMS发酵速率减缓是导致其干预效果不理想的主要诱因。最后比较了不同干预模式对小鼠粪便菌群多样性、物种组成和表型分布的影响,发现BHAMS的干预效果已与TB相近,并明显优于HAMS,这主要得益于BHAMS中丁酰基基团的代谢,同时也证实了丁酸酯淀粉的丁酸载体属性在其调节肠道稳态方面的重要性。
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