【摘 要】
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随着全球人口老龄化的日趋严重,患老年认知功能障碍的病人日益增多,已成为公共卫生安全领域不容忽视的问题。研究改善认知功能障碍功效成分及其作用机制具有重大的社会意义。有研究报道牡蛎酶解产物具有良好的提高小鼠学习记忆的功效,但不够系统深入,且尚未见利用自然衰老动物开展牡蛎改善认知功能障碍方面的研究报道。本论文以香港牡蛎(crassostrea hongkongensis)为研究对象,提取蛋白后酶解获得酶
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随着全球人口老龄化的日趋严重,患老年认知功能障碍的病人日益增多,已成为公共卫生安全领域不容忽视的问题。研究改善认知功能障碍功效成分及其作用机制具有重大的社会意义。有研究报道牡蛎酶解产物具有良好的提高小鼠学习记忆的功效,但不够系统深入,且尚未见利用自然衰老动物开展牡蛎改善认知功能障碍方面的研究报道。本论文以香港牡蛎(crassostrea hongkongensis)为研究对象,提取蛋白后酶解获得酶解产物,以自然衰老的斑马鱼作为动物模型对超滤组分进行活性优选,并探究最优组分对老年斑马鱼认知功能障碍的功效;采用离子交换层析、凝胶层析、半制备色谱、ESI-MS/MS等方法对活性肽进行分离纯化,鉴定其氨基酸序列;利用人工合成肽,采用体外细胞实验探究其改善认知功能障碍的分子机制,为牡蛎在改善认知功能障碍方面的功能食品开发提供理论依据。主要研究内容及结果如下:(1)高剂量牡蛎酶解产物可显著延长避暗实验小鼠进入暗室的潜伏期,缩短水迷宫实验上台前路程及潜伏期,提高小鼠穿越平台的次数,表明其具有改善小鼠学习记忆的功效;中低剂量牡蛎酶解产物的改善作用低于高剂量组。(2)超滤组分(>8 k Da(UF1)、8-5 k Da(UF2)、5-3k Da(UF3)、<3k Da(UF4))中,UF2对老年斑马鱼认知功能障碍的改善作用最显著,在行为学测试的第四天可显著提高斑马鱼进入食物放置区的成功率,缩短潜伏期,并延长第二、三、四天的游动路程及时间;测定超滤组分的营养成分,UF2的芳香族氨基酸、疏水性氨基酸、谷氨酸及天冬氨酸的含量高于其他三个组分。测定超滤组分的抗氧化、抗炎活性及神经递质的含量,UF2能显著清除羟自由基及超氧阴离子自由基,降低LPS刺激引起升高的BV2细胞活力,提高老年斑马鱼CAT、SOD的活力水平及Ach和r-GABA的含量,推测UF2改善老年斑马鱼认知功能障碍的功效可能与提高斑马鱼抗氧化、抗炎活性、上调神经递质的分泌有关。(3)行为学显示老年鱼认知能力低于青年鱼,喂食UF2能提高老年斑马鱼进入食物放置区的成功率,右臂游动路程及时间,并降低潜伏期,表明其具有改善老年斑马鱼认知功能障碍的功效;生化指标、基因表达等结果表明UF2能提高老年斑马鱼的SOD、CAT的活力,降低MDA、IL-1β、TNF-α的含量及cd11b、sabg的基因表达水平,上调gfap、psd-95、bdnf、trkb的基因表达水平及Ach、r-GABA、BDNF的含量;并能提高神经细胞的数量,改善细胞凋亡。推测UF2改善老年斑马鱼认知功能障碍的功效可能是通过调节胶质细胞功能、减少氧化应激和炎症,上调BDNF、trk B、神经递质的水平,来增强突触功能,起神经元的保护作用。(4)UF2经分离纯化和质谱分析鉴定出14条活性肽,通过分子对接技术,确定IDYER(5肽)和IAFIMDESNVLDSGFLER(18肽)具有较好的激活CREB活性。(5)细胞实验表明:人工合成的IDYER和IAFIMDESNVLDSGFLER均可显著抑制LPS激活的BV2细胞内ROS及NO的生成,有效干预D-gal诱导的SH-SY5Y细胞老化,抑制NF-κB P65的磷酸化和IκB的降解;提高ERK1/2和CREB的磷酸化水平,下调BAX的表达并上调BCL-2的表达。推测其分子作用机制可能是通过抑制NF-κB/IκB信号通路及凋亡通路,激活ERK-CREB信号通路来发挥改善老年认知功能障碍的功效。
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