研究背景及目的：当前，冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗已经进入药物支架时代。药物支架是针对既往单纯球囊扩张以及裸金属支架植入后再狭窄而研发的，而再狭窄产生的病理生理基础是血管损伤后平滑肌细胞的异常增殖、迁移，进而导致的血管内膜增殖和管腔狭窄。目前，临床常用的药物支架能够显著抑制血管平滑肌细胞的增殖和血管内膜的增生，大大降低了血管再狭窄的比例；但是目前支架药物特异性不够高，引发内皮延迟愈合及支架内血栓等严重并发症。而且血管损伤后内膜增生这一仍旧困扰动脉粥样硬化治疗难题的机制也未完全阐明。因此，深入探讨血管损伤后内膜增生机制，寻找新的潜在药物靶点及研发新型治疗药物，对进一步提升抗动脉粥样硬化治疗效果和降低血管再狭窄发生率有重要意义。一、泛素活化酶E1：血管损伤后新的潜在治疗靶点泛素蛋白酶体系统主司机体蛋白质的降解，并参与多种病理生理过程。蛋白质的降解，分为蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个步骤。泛素是由76个氨基酸组成，是蛋白质被降解的“标签”。蛋白质泛素化是一个由E1-E2-E3级联酶促催化的过程，并最终将泛素共价连接到蛋白质。生物体内仅存1-2分子泛素活化酶E1，而有20-30个E2，数百个E3分子；泛素化修饰的蛋白质进而被蛋白酶体降解。既往研究报道，泛素蛋白酶体系统参与血管动脉粥样硬化及血管损伤修复过程。最早有研究认为在动脉粥样硬化及血管新生内膜中均出现泛素蛋白酶体系统功能异常；近年亦发现，蛋白酶体抑制剂可减少血管损伤后内膜增生。体外研究也表明蛋白酶体抑制剂可减缓平滑肌细胞的增殖、迁移、表型转化。上述研究揭示了蛋白酶体参与血管损伤内膜增生的作用及机制，但对于泛素化过程的作用尚不清楚。在泛素酶促反应体系中，泛素活化酶E1是该系统的起始分子，是生物体内是启动蛋白降解的开关，同时在大多数生物体内仅存1-2个蛋白，且以UBE1/UBA1功能为主。鉴于蛋白酶体在血管损伤修复中的重要作用，我们推测泛素活化酶E1可能在血管损伤后内膜增生起重要作用。因此，在本课题第一到第四部分，我们从动物模型和细胞水平验证泛素活化酶E1在血管损伤后内膜增生的作用及其药物靶点的价值。以期为进一步阐明泛素活化酶E1在血管损伤中的作用提供实验依据，并为抑制血管损伤后内膜增生和治疗再狭窄提供新的思路。二、H₂：抑制血管损伤后内膜增生的新型抗氧化剂众所周知，氧化应激在血管损伤后内膜增生中起重要作用。血管损伤诱发血管局部氧化应激，加剧炎症浸润，加重血管内膜增生。既往针对血管损伤后的氧化应激的动物实验研究取得诸多进展；然而，临床研究提示抗氧化治疗并未给病人带来显著收益。这就提示仍需深入研究机体血管损伤后的氧化应激并寻找新型的抗氧化剂。自2007年以来，H₂在生物体被认为是新型抗氧化剂，并在多种病理生理过程中被证明具有良好的抗氧化效应。因此，在本课题第五部分，我们探讨了H₂对血管损伤后内膜增生的影响及其机制，为H₂潜在的抗血管内膜增生的药物价值提供实验依据。研究方法：1.血管损伤内膜增生局部泛素蛋白酶体系统的改变以及局部给予化学抑制剂后内膜增生的情况1.1制备大鼠血管球囊损伤模型，提取蛋白质，采用Western Blot方法检测血管损伤后7d、14d泛素活化酶E1以及泛素化蛋白质的表达水平；同时采用免疫染色，检测血管损伤后泛素化蛋白质表达的定位。1.2泛素活化酶E1化学抑制剂PYR-41（100μM）以及对照组DMSO溶液经由颈外动脉注入50μL，室温持续30min。术后7d、14d，HE染色检测血管损伤后内膜增生情况，计算其内膜面积、中膜面积和两者比值。2.血管损伤局部E1基因敲减对血管损伤后内膜增生的影响2.1构建泛素活化酶E1基因干扰慢病毒：设计四对基因干扰序列，构建干扰质粒载体，转染VSMCs，采用Realtime RCR方法检测其具体的干扰效率，优选出两对效率较高的序列；将优选序列构建入慢病毒表达载体，进而和包装质粒和胞膜质粒一起包装、制备慢病毒。2.2泛素活化酶E1干扰慢病毒转染损伤血管：将包装的慢病毒首先转染离体培养的VSMCs，检测其转染效率和敲减泛素活化酶E1的效率；将转染效率最高的慢病毒在血管损伤局部转染，在3d、7d、14d通过对GFP的Western Blot和免疫组化检测其转染效率；并在血管损伤后7d、14d行HE染色，检测其血管内膜增生情况。3.损伤血管局部泛素活化酶E1抑制后对凋亡及炎症的影响。通过TUNEL方法检测在血管局部给予化学抑制剂PYR-413h、8h后，损伤血管局部的凋亡细胞数量；并在给予PRY-41和干扰慢病毒组进行免疫荧光化学、WesternBlot检测7d、14d时损伤血管的NFκB、CD68的表达、定位情况；EMSA检测损伤血管NFκB的DNA结合活性。4.泛素活化酶E1抑制后对体外培养VSMCs功能的影响及机制4.1通过组织块培养法培养VSMCs，并采用SM α actin免疫荧光化学进行鉴定；在不同浓度的PYR-41以及干扰慢病毒处理VSMCs后，分别采用细胞计数、3H-TdR掺入检测对VSMCs的增殖的影响；流式细胞仪检测PYR-41处理及干扰慢病转染VSMCs后各个细胞时期的比例；流式细胞仪Annexin V/PI染色检测VSMCs凋亡的情况。4.2VSMCs在PYR-41处理以及干扰慢病毒处理后，提起其蛋白质检测短半衰期蛋白质p21、p53、c-jun的含量，以及IκBα、IκBβ的含量；EMSA检测在PYR-41处理以及干扰慢病毒处理后，NFκB的活化。5.检测富含氢气生理盐水对血管损伤后内膜增生的影响并探讨机制5.1检测富含氢气生理盐水的pH值以及体内注射后，其在血相含量的变化5.2采用富含氢气生理盐水注射球囊损伤后大鼠，10mL/kg，分别在14d以及21d，采用HE染色计算其血管损伤后内膜面积5.3富含氢气生理盐水治疗球囊损伤大鼠后，检测损伤血管局部ROS含量；并测量血管及血清SOD、GSH、MDA的含量；分别采用PCR、ELISA检测IL-6的mRNA和蛋白质水平的变化；采用Western Blot检测血管损伤局部NFκB和TNFα的变化5.4采用细胞计数和CCK-8检测富含氢气培养基对体外培养VSMCs的增殖的变化影响；采用改良的Boyden小室检测富含氢气培养基对VSMCs迁移的影响实验结果：1.大鼠颈动脉球囊损伤后，泛素化蛋白质的表达在7d和14d时，明显增高（p<0.05）。而同时泛素化酶E1的表达水平并未随着时间而增高（p>0.05）。增强的泛素化蛋白质的表达定位在血管新生内膜。局部给予泛素活化酶E1化学抑制剂可在第7d、14d显著减少血管内膜面积（p<0.05）；且新生内膜的PCNA阳性细胞数也显著减少（p<0.05）。2.测序报告提示，成功构建泛素活化酶E1的干扰质粒；初步筛选出干扰效率较高的两条序列CTCTTGTTGAAGACTTCCTTA，CCTGGGATGTCACGAAGTTAA。构建入慢病毒载体，包装、制备成慢病毒，其滴度分别为1.02×109/mL和8.22×108/mL。转染VSMCs后，转染效率为90.3±0.9%，可有效降低泛素活化酶E1的mRNA水平和蛋白质水平。损伤局部给药后，免疫组化在转染后3d观察到GFP的表达，Western Blot检测到7d、14d GFP的表达，表明慢病毒可有效转染血管局部。在转染后7d、14d，HE染色可见内膜增生显著减少（p<0.01），分别下降42.4%和32.5%。PCNA阳性细胞比例由对照组的40.12±3.81%显著下降到病毒干扰组的22.17±1.53%。3.和对照组比较，PYR-41局部损伤血管给药在3h、8h可显著增加诱导血管壁细胞凋亡数量。PYR-41和干扰慢病毒均可减少NFκB p65的表达和核转位减少，减弱其DNA结合活性。免疫组化和Western Blot也表明，损伤血管局部PYR-41处理和慢病毒干扰后，CD68阳性的单核巨噬细胞的浸润减少。4.在体外培养的原代VSMCs上，PYR-41可显著抑制VSMCs的增殖，且呈浓度依赖型。干扰慢病毒敲减E1后，也显著抑制了VSMCs的增殖。PYR-41和干扰慢病毒均可减少VSMCs的S期细胞比例。PYR-41在诱导VSMCs的凋亡，且呈浓度依赖性。PYR-41和干扰慢病毒均可阻断短半衰期蛋白质的降解，显著增加了p21、p53、c-jun等分子的蛋白质水平（p<0.01）。Western Blot发现泛素活化酶E1抑制降低了VSMCs NFκB p65蛋白质水平；EMSA也表明泛素活化酶E1抑制后，NFκB的活性下降，并且其对NFκB的活性抑制是通过减少IκBα和IκBβ降解介导的。5.富含氢气生理盐水注射机体后，可在30min内显著增加血浆内H₂浓度；注射富含氢气生理盐水可显著减少血管内膜增生，PCNA阳性细胞比例也由21.03±2.56%显著下降到富含氢气生理盐水治疗组的9.17±4.86%（p<0.05）。富含氢气生理盐水可降低损伤血管局部ROS水平，减少组织局部和血清的MDA水平（p<0.05），增加血管损伤局部和血清的SOD、GSH水平（p<0.05）。富含氢气生理盐水还减少了血管局部IL-6、TNFα、NFκB p65的表达水平和CD68阳性单核巨噬细胞的浸润（p<0.05）。在离体VSMCs上，富含氢气生理盐水还减少了高糖诱导的8-OdH以及PDGF-BB诱导的ROS增加；并同时减弱了PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖和迁移能力（p<0.05）。结论：1.血管损伤后新生内膜局部泛素化蛋白质表达增高。2.局部化学抑制或基因敲减泛素活化酶E1可有效抑制血管损伤后内膜增生。3.局部化学抑制或者基因敲减泛素活化酶E1后可减弱血管局部炎症反应。4.化学抑制剂PYR-41可诱导VSMCs的凋亡；而化学抑制或者基因敲减均可抑制VSMCs的增殖及细胞周期进展。5.化学抑制或者基因敲减均可抑制VSMCs短半衰期蛋白质的降解和NFκB活化。6.氢气可有效抑制血管损伤后内膜增生；并抑制血管局部的ROS生成和TNFα/NFκB通路；H₂还可抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增生和迁移。