新型聚阳离子基因载体模型的构建

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本论文的研究内容包括两个部分:第一部分探索适用于氧阴离子聚合的不同结构的引发剂与单体,探讨了氧阴离子聚合的聚合机理;第二部分利用氧阴离子聚合与层层组装技术的优势,设计一种新型聚阳离子基因载体模型,并对其进行系统的研究。(1)利用氧阴离子聚合原理,分别采用胆固醇(Cholesterol)和单甲基封端的聚乙二醇(MePEG)与KH反应作为引发剂体系,单体为甲基丙烯酸-2-(N,N-甲氨基)乙酯(DMAEMA)和甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA),成功合成结构明确的功能性聚合物Chol-PDMAEMA和MePEO-b-PtBMA。通过1H NMR和GPC测试分别获得聚合物的分子量及分子量分布数据。结果表明,所得聚合物的分子量分布较窄,聚合物分子量的实验值与理论值较吻合。本研究首次发现甲基丙烯酸叔丁酯同样适用于氧阴离子聚合反应,修正了以前文献中对于氧阴离子聚合机理的认识,为开发适合氧阴离子聚合的单体提供更有力的支撑。(2)设计构建一种新型聚阳离子型因载体模型。该模型以Chol-PDMAEMA为聚阳离子,以功能化的MePEG2000-b-PMAASH为聚阴离子,构建基因载体模型,其步骤分为以下三步:(i)将DNA与聚阳离子Chol-PDMAEMA30复合,形成表面带正电荷的Chol-PDMAEMA30/DNA复合物;(ii)为了克服复合物表面带正电荷所引起的非特异性清除,使用功能化的聚阴离子MePEG2000-b-PMAASH,通过静电力作用包裹Chol-PDMAEMA30/DNA复合物,屏蔽表面的正电荷,获得MePEG2000-b-PMAASH/Chol-PDMAEMA30/DNA复合物;(iii)为提高载体的稳定性,向上述复合物溶液中加入过氧化氢,氧化MePEG2000-b-PMAASH中的巯基(-SH),使巯基之间形成二硫键(S-S),.固定壳层。通过对每一步复合过程的Zeta电位、粒径与透射电镜的研究,表明所设计的载体模型符合预期的结果。通过临界胶束浓度测试、凝胶电泳实验和溴已锭取代实验,研究低分子量聚阳离子Chol-PDMAEMA30与DNA结合能力以及Chol-PDMAEMA30/DNA复合物的稳定性,研究结果表明,Chol-PDMAEMA30是一种高效的聚阳离子型基因载体。通过凝胶电泳实验与溴已锭取代实验,研究在使用该模型构建基因载体中一个至关重要的协同链交换问题,定性及定量化的研究结果表明当MePEG2000-b-PMAASH中[MAA]与Chol-PDMAEMA中[DMAEMA]的摩尔量比为1:1时较为合适。通过体外模拟,研究载体在细胞外与细胞内环境下的理化性能。研究结果表明,这类复合基因载体在血液传输过程中是稳定的,但是,当进入到细胞内部,由于细胞内的还原作用,二硫键断裂,载体的胶囊结构被破坏,DNA被释放。
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