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玉米在整个生长过程中会受到许多不良环境条件的胁迫,严重影响玉米生长发育和产量。其中,以干旱、低温和盐渍等非生物逆境胁迫最为严重。利用转基因技术转化培育抗逆新品种,是解决这些问题的关键之一。然而,在很多抗逆转基因研究中,都采用组成型启动子启动抗逆基因的表达。虽然提高了对非生物逆境的抵抗能力,但在没有受胁迫时基因的过量表达,却造成了能源的浪费,对植物自身的一些生理代谢活动却产生了抑制作用,反而导致植株矮小,产量降低。再者,因为种属之间存在特异性,外源诱导启动子的启动效能一般不及内源启动子。目前关于玉米内源逆境诱导启动子的研究比较少。因此,克隆验证玉米内源诱导启动子,并研究其表达调控机制,有利于了解玉米胁迫应答机制,为玉米抗逆转基因研究提供更多的选择。 在前期研究中,我们从玉米中克隆了MGL3s和sbCBF6s启动子,经瞬时表达验证具有多种非生物胁迫诱导活性。MGL3s在非胁迫条件下启动活性较低,在干旱、高盐等胁迫条件下启动活性较高。而sbCBF6s的启动活性对干旱、高盐、ABA等非生物逆境胁迫的响应不显著,只有在低温胁迫下升高。为进一步验证这两个启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性,并评价不同顺式作用元件对启动活性的影响,本研究先用植物启动子分析软件PlantCARE查找MGL3s和sbCBF6s序列内的TGACG、MBS、CGTCA、ARE、 HSE等与渗透胁迫相关及温度相关的顺式作用元件。然后根据分析结果设计引物,PCR扩增去除不同顺式作用元件的5-端缺失启动子序列,构建启动GUS基因的表达载体,农杆菌介导法转化拟南芥或烟草。用20%聚乙二醇-6000模拟干旱、0.4 mol/L NaC1高渗及对照条件处理T1代拟南芥,诱导MGL3s启动子启动GUS基因的表达。GUS组织化学染色结果表明,5-端缺失不同长度的5个MGL3s启动子序列启动的GUS基因,在拟南芥转化体的叶脉或茎中都只有微弱表达。5-端缺失不同长度的MGL3s和sbCBF6s启动子序列,均能在转化烟草叶盘在抗性培养基上长出的阳性愈伤中启动GUS基因的表达。MGL3s和sbCBF6s启动子能够保持启动活性的最短片段分别为325 bp(-175 bp至+150 bp)和185 bp(-77 bp至+108 bp)。 上述结果说明,MGL3s启动子具有单子叶植物特异性,在双子叶植物拟南芥中只能启动基因的微弱表达。MGL3s启动子保持启动活性的最短序列是从+150bp上游的325bp序列。sbCBF6s可在单子叶和双子叶植物中启动基因表达,保持启动活性的最短序列是从+108bp上游的185bp序列。