研究背景与目的噬肝病毒之一的乙型肝炎病毒（HBV）可在人体中建立持续和慢性感染。目前,全球约有3.5%的人口慢性感染乙肝病毒。如果乙肝病毒感染得不到及时地诊断或治疗可能会恶化为肝硬化和肝细胞肝癌（HCC）等疾病。据报道,全球所有的HBV感染者中只有约10%得到诊断,而接受正规抗病毒治疗者的比例就更小。目前5岁以下儿童中感染HBV的人数因HBV预防性疫苗的应用已显著减少。而核苷（酸）类似物以及干扰素仍是临床抗HBV感染的主要治疗药物,但这些药物存在病毒耐药以及副作用较大等问题。因此,亟需开发新型抗HBV药物。Neddylation是一种将发育蛋白8（NEDD8）（由神经元样分子的前体细胞表达）添加到底物蛋白的赖氨酸残基上的翻译后修饰过程,可调节蛋白质的稳定性、亚细胞定位和功能,是机体用来适应外界环境变化维持内部稳态的一个重要修饰过程,其与机体发育性疾病、肿瘤以及病毒感染之间都存在着十分密切的联系。本研究将利用体内外HBV表达模型验证Neddylation抑制剂MLN4924的抗病毒作用,并探讨其作用机制。明确MLN4924作为治疗HBV感染新药的有效性,为临床HBV感染的诊治提供新的方法与手段。研究方法第一部分:利用蛋白印迹（Western Blot）技术检测NEDD8在稳定表达HBV模型Hep G2.2.15细胞系、Hep AD38细胞系、HBV瞬时表达细胞模型以及小鼠HBV复制模型中的表达情况。利用稳定表达HBV模型Hep G2.2.15细胞株以及瞬时表达HBV的细胞模型体外验证MLN4924的抗病毒效果;利用高压水动力法将p AAV-1.2HBV质粒10μg/只注入尾静脉,建立小鼠HBV复制模型,验证MLN4924在体内的抗病毒效果。测定上述HBV表达小鼠模型血清转氨酶水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）技术检测细胞上清和小鼠血清HBV DNA,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞上清及血清病毒抗原。利用免疫荧光（IF）技术检测细胞内HBV抗原表达及定位,利用免疫组织化学（IHC）技术检测小鼠肝脏HBV病毒抗原及相关目的蛋白。利用RT-q PCR技术检测HBV 3.5k RNA与ccc DNA表达水平;利用DNA印迹（Southern Blot）技术检测HBV ccc DNA。第二部分:利用报告基因检测技术检测HBV启动子的表达活性。采用RT-q PCR以及Western Blot技术检测肝脏富集转录因子m RNA表达与蛋白表达。通过细胞热转变分析实验（CETSA）的方法确定MLN4924与细胞内靶蛋白的亲和力。利用RT-q PCR技术检测HBV DNA,利用雅培ELISA试剂盒检测HBV病毒抗原。研究结果第一部分:HBV的体外以及体内模型显示HBV可促进细胞内Neddylation修饰。在体外,Neddylation抑制剂MLN4924可抑制HBV稳定以及瞬时表达模型中病毒的复制;在体内,MLN4924可降低高压水动力法尾静脉注射HBV质粒构建的HBV表达小鼠体内的病毒载量。更重要的是,体外结果表明MLN4924可以抑制HBV 3.5k RNA以及HBV最重要的转录模板ccc DNA的表达。第二部分:MLN4924可以抑制HBV 4个启动子（X,pre S1,pre S2,C）的表达活性以及肝脏富集转录因子HNF1α、C/EBPα、HNF4α的表达。进一步的研究发现MLN4924通过激活MAPK信号通路中的ERK来抑制肝脏富集转录因子HNF1α、C/EBPα、HNF4α的表达从而在转录水平起到抗HBV的作用。研究结论（1）Neddylation抑制剂MLN4924可抑制体内外HBV的复制。（2）Neddylation抑制剂MLN4924可抑制HBV ccc DNA表达。（3）Neddylation抑制剂MLN4924通过ERK/HNF1α/C/EBPα/HNF4α通路抑制HBV启动子活性从而发挥抗HBV作用。