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目的:结直肠癌(colonrectalcancer,CRC)是当今世界发病率排名第三的恶性肿瘤,每年导致全球约百万人死亡,虽然死亡率有所下降,但发生率仍持续上升,应将预防作为控制结直肠癌的重心,即“关口前移”。山奈酚是一种多酚类抗氧化剂,来源于60多种常见果蔬和传统中药。流行病学研究显示山奈酚的摄入量与包括癌症在内的多种慢性疾病发生率呈反比。体外研究证明山奈酚可调节与肿瘤细胞凋亡、血管再生、炎症和转移相关的多条细胞信号转导通路。值得关注的是,山奈酚可诱导肿瘤细胞凋亡,同时对正常细胞起保护作用,使其可能成为潜在的肿瘤化学预防药物。除此之外,染色质表观遗传改变亦成为诱导结直肠癌的关键病因,主要包括肿瘤抑制基因启动子区CpG岛甲基化沉默和选择性的组蛋白修饰。然而,尚未有文献报道山奈酚化学预防肠炎相关性结直肠癌的作用及机制。基于目前研究现状,本文将采用AOM/DSS小鼠模型评价山奈酚对结直肠癌的化学预防作用,并在体外细胞模型中验证其对结直肠癌肿瘤抑制因子甲基化调控及抗炎作用机制。方法:1.山奈酚对结肠癌细胞活力及DACT2 mRNA表达水平影响采用商业化的结肠癌细胞系HCT-116和HT-29细胞作为体外研究模型,经不同浓度山奈酚(0-150 μM)给药5天后,以MTT法检测山奈酚对两种细胞系抗增殖作用并确定山奈酚给药浓度与给药时间。并通过实时定量PCR(Real time PCR)检测 DACT2 mRNA 水平。2.山奈酚对结肠癌细胞DACT2基因表观遗传调控研究基于MTT实验确定的给药浓度,利用western blot技术,检测山奈酚对结肠癌细胞甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶表达水平影响,并采用MSP实验验证山奈酚对HCT-116和HT-29细胞启动子区CpG岛的去甲基化作用。3.山奈酚对DA4CT2下游Wnt/β-catenin信号通路作用研究首先进行RT-PCR和Western blot实验,检查山奈酚对HCT-116和HT-29细胞Wnt/β-catenin信号通路关键基因和蛋白表达水平的影响。此外采用流式细胞术检测不同给药组细胞周期分布比例及细胞凋亡情况。另外,通过细胞划痕实验检查山奈酚对HCT-116和HT-29细胞迁移能力的影响。最后,检测细胞上清基质金属蛋白酶(MMPs)水平。4.考察山奈酚对结直肠癌抗炎作用采用商业化的结肠癌细胞系LS174T和Caco-2细胞作为体外研究模型,经MTT实验确定山奈酚给药浓度与给药时间。并通过Western blot实验,检查山奈酚对两种细胞NF-κB炎症信号通路蛋白表达水平的影响。另外采用免疫组织化学方法考察Nrf2蛋白表达。5.山奈酚对结直肠癌动物模型化学预防作用研究采用AOM/DSS诱导炎症性结直肠癌动物模型,经75 mg/kg,150 mg/kg山奈酚给药20周,考察山奈酚在结直肠癌形成和发展过程中的化学预防作用。统计动物体重变化,采用ELISA试剂盒检测血浆炎症因子水平,HE染色检查结直肠病理改变,免疫荧光法检查结直肠组织PCNA,β-catenin蛋白的表达,RT-PCR法检测DACT2,LRP6和β-catenin基因表达水平。6.统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,多组间均数比较采用One way ANOVA,p<0.05表示具有显著学差异。采用GraphPad5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean ± SD表示。结果:1.山奈酚显著抑制结肠癌细胞活力并上调DACT2mRNA表达水平经山奈酚给药5天后,5 μM山奈酚对HT-29细胞表现出显著的抑制作用。根据MTT检测结果,保证80%以上细胞可存在,因此确定山奈酚给药浓度为0,1.25,2.5,5 μM,给药时间5天。2.山奈酚在表观遗传水平调控结肠癌细胞DACT2基因表达实验结果显示,山奈酚可抑制两种细胞甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶表达,另外,山奈酚降低HCT-116和HT-29细胞DACT2基因甲基化水平。3.山奈酚抑制DACT2下游Wnt/μ-catenin信号通路研究结果表明,随着给药浓度的增加,HCT-116和HT-29结肠癌细胞DACT2下游Wnt/β-catenin通路关键基因μ-catenin,Dvl3,LRP6,Wnt 5a/b被抑制,且呈剂量依赖性。而在蛋白水平上,HCT-116结肠癌细胞Wnt 5a/b,Naked2,LPR6,Dvl2,Dv13,μ-catenin蛋白表达被显著抑制,HT-29细胞Wnt5a/b,μ-catenin被显著抑制。另外,山奈酚可将两种细胞周期阻滞于G1期并诱导细胞凋亡。同时,山奈酚抑制两种细胞迁移和MMPs的分泌。4.山奈酚的抗炎作用高浓度山奈酚显著抑制LS174T和Caco-2细胞增殖活力,另外,NF-κβ炎症信号通路相关蛋白表达亦被显著抑制。此外,LS174T细胞Nrf2蛋白被高浓度山奈酚诱导上调。5.山奈酚体内化学预防结直肠癌作用及机制在AOM/DSS诱导炎症性结直肠癌动物实验中,山奈酚能显著降低结直肠肿瘤的发生率,且对抗AOM/DSS对结直肠的损伤,而各组体重并无显著性差异;另外,血浆炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α被抑制,HE染色检查表明山奈酚能降低AOM/DSS导致的结直肠炎性细胞浸润,且下调PCNA,μ-catenin蛋白表达,上调DACT2并下调μ-catenin和LRP6基因表达。结论:本文将研究山奈酚对结直肠癌化学预防作用,探索其体内外作用机制,发现山奈酚可能通过调控DNMTs和HDACs蛋白表达,从而降低结直肠癌抑制因子DACT2基因表达水平,随着DACT2基因表达的恢复,Wnt信号通路被抑制,从而阻滞肿瘤细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制转移性肿瘤的迁移并抑制MMPs。另外,山奈酚可能通过NF-κB炎症信号通路减少机体炎症并增强机体抗氧化能力。因此,本研究可为山奈酚用于结直肠癌肿瘤化学预防提供一定理论依据。