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目的:人脑微血管内皮细胞（Human Brain Microvascular Endothelial Cells,hBMECs）凋亡是阿尔茨海默病（Alzheimer`s disease,AD）发病重要机制之一。hBMECs是血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）的主要成分之一,β淀粉样肽1-42(amyloid-β1-42,Aβ1-42)通过诱导hBMECs凋亡引起血脑屏障通透性增加,沉积于神经元细胞,导致神经元变性坏死,功能受损,促进AD的发生发展。Aβ诱导hBMECs凋亡机制目前并不清楚,可能与TLR4/NF-κB信号通路激活有关。积雪草苷（Asiaticoside,AS）具有抗炎,抗氧化,抗凋亡作用,但AS对Aβ诱导的hBMECs细胞凋亡有无抑制作用,其分子机制是否与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关并不清楚。因此,本研究通过建立Aβ诱导hBMECs细胞凋亡模型,探索积雪草苷对Aβ1-42诱导hBM ECs凋亡的作用,并阐明其相关机制,为积雪草苷治疗阿尔茨海默病提供理论依据。方法:（1）积雪草苷干预浓度选择:用不同浓度积雪草苷（3.125μmol/L,6.25μmol/L,12.5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L）分别处理hBMECs 6h,12h,24h,48h,CCK-8法检测hBMECs细胞活性。（2）Aβ1-42刺激hBMECs最适浓度和时间:用不同浓度Aβ1-42（12.5,25,50,100,200μmol/L）分别处理hBMECs 6h,12h,24h,48h,CCK-8法检测hBMECs细胞活性。（3）CCK-8法检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞活性影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/LAβ1-42处理细胞24h,CCK-8法检测细胞活性;（4）Hoechst33258染色检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,采用Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况;（5）Annexin V-FITC检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;（6）荧光显微镜检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后线粒体膜电位影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/L的TAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,JC-1染色后采用荧光显微镜检测细胞线粒体膜电位;（7）Western blot法检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后MyD88依赖的TLR4信号通路主要蛋白表达影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs 12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,采用Western blot检测TLR4,MyD88,TRAF6,p-NF-κB p65,total NF-κB p65蛋白表达情况。（8）免疫荧光染色检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞内NF-κB p65核转移影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/L TAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,采用免疫荧光染色检测细胞内NF-κB p65蛋白核转移情况;（9）ELISA法检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后炎症因子TNF-α及IL-6影响:将细胞分为阴性对照组,模型组,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后,阴性对照组不做处理,模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h,积雪草苷25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L组,TAK-242组先分别采用25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h,再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h,取细胞培养上清液,采用ELISA法检测炎症因子TNF-α及IL-6含量。结果:（1）积雪草苷干预浓度选择:与阴性对照组比较,积雪草苷3.125,6.25,12.5,25,50,100μmol/L处理6h,12h,24h,48h后细胞活性无明显变化,积雪草苷200μmol/L处理细胞24h,48h活力稍下降,比较无显著差异（p>0.05）。（2）Aβ1-42刺激hBMECs最适浓度和时间:与阴性对照组比较,Aβ1-4212.5,25μmol/L处理6h,12h,24h,48h,Aβ1-4250,100μmol/L处理hBMECs 6h,12h,Aβ1-42200μmol/L处理6h细胞活性无明显变化,比较无显著差异（p>0.05）;Aβ1-4250,100μmol/L处理hBMECs24h,48h,Aβ1-42-42 200μmol/L处理12h,24h,48h细胞活性明显降低,差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。（3）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞活性影响:与阴性对照组比较,模型组细胞活性明显降低（p<0.01）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组可增加细胞活力,差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。（4）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影响:与阴性对照组比较,模型组细胞核出现明显亮蓝色,凋亡细胞明显增加,差异有统计学意义（p<0.05）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组凋亡细胞减少,差异有统计学意义（p<0.05）。（5）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影响:与阴性对照组比较,模型组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（p<0.05）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组细胞凋亡率降低,差异有统计学意义（p<0.05）。（6）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后线粒体膜电位影响:与阴性对照组比较,模型组hBMECs细胞膜电位明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组细胞明显增加由Aβ1-42（50μM）降低的线粒体膜电位,差异有统计学意义（p<0.01）。（7）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后MyD88依赖的TLR4信号通路主要蛋白表达影响:与阴性对照组比较,模型组TLR4,MyD88,TRAF6,p-NF-κB p65等蛋白表达明显增加,差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组细胞TLR4,MyD88,TRAF6,p-NF-κB p65等蛋白表达明显降低,差异有统计学意义（p<0.01）。（8）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞内NF-κB p65核转移影响:与阴性对照组比较,模型组可明显增加NF-κB p65核转移细胞数,差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组细胞可显著减少NF-κB p65核转移的阳性细胞数,差异有统计学意义（p<0.05）。（9）积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后炎症因子TNF-α及IL-6影响:与阴性对照组比较,模型组显著诱导hBMECs细胞释放炎性因子TNF-α及IL-6,差异有统计学意义（p<0.05）;与模型组比较,积雪草苷25μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组和TAK-242组细胞TNF-α及IL-6表达水平明显减少,差异有统计学意义（p<0.01）。结论:（1）积雪草苷可以降低Aβ1-42诱导的hBMECs细胞凋亡。（2）积雪草苷可以抑制TLR4/NF-κB信号通路中TLR4,MyD88,TRAF6,p-NF-κB p65蛋白表达,抑制细胞NF-κB核转移,抑制炎性因子TNF-α与IL-6释放。