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甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物,用途广泛。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)属于17-酮类固醇家族,是用来生产甾体药物的关键中间体。AD和ADD可通过侧链降解甾醇(包括植物甾醇和胆固醇等)获得,自20世纪50年代以来,已经有大量的文献报道利用微生物催化的侧链降解反应获得AD和ADD。目前高产菌株的获得和转化效率的提升是微生物法制备雄甾(二)烯二酮面临的主要问题。本实验室保藏的基因工程菌新金分支杆菌(Mycobacterium neoaurum)MS261和新金分支杆菌R10,能够分别单独积累ADD和AD,从分子水平解决了植物甾醇侧链降解过程中副产物多的问题。本实验的主要的目的为分别对这两株菌侧链降解植物甾醇生产AD(D)的过程进行优化,提高植物甾醇侧链降解的效率,提升产物AD(D)的产率,为后续AD(D)的实际生产奠定了基础,主要包含以下内容:针对ADD生产菌株Mycobacterium neoaurum MS261,确定接种种龄为24 h,接种量为16%;在2g/L的底物浓度下,投料时间为0h(即接种时投料),以10g/L的葡萄糖和5 g/L的酵母粉作为有机碳氮源时,ADD的产率最高,20 g/L的葡萄糖能够使MS261不再积累ADD转而积累睾酮和脱氢睾酮;相比于生长细胞,静息细胞侧链降解植物甾醇的效率更高,但积累ADD的能力较差。针对AD生产菌株Mycobacterium neoaurum R10,首先考察了底物投加方式和培养基组分对转化结果的影响,在3 g/L投料浓度下,接种后24-48 h内分两次投入底物,AD得率最高,为31.7%;转化培养基中缺失柠檬酸时,AD无法生成,培养基中加入50 mM的碳酸氢钠时,AD产率较对照提升29.8%,确定最优碳氮源组合为10 g/L葡萄糖和3 g/L酵母粉,在5 g/L投料浓度下,AD产率达35%。另外研究了转化过程中抑制产物降解的方法,发现过程中补糖可以抑制产物的降解,在糖耗光后一次性补加初始浓度的葡萄糖后,AD积累速率提升,AD终产率较对照组提升39.1%;加入EDTA能够抑制产物的降解,但同时侧链降解即产物的生成也被抑制。静息细胞在0-4 d之内对底物利用效率很低,4 d之后底物被加速利用而产物也被迅速降解,向转化体系中加入EDTA可以显著抑制产物降解,同时也会抑制植物甾醇的侧链降解,目前尚无静息细胞生产AD的报道。