论文部分内容阅读
目的:妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期发生或首次发现的严重程度不同的糖代谢异常性疾病,是妊娠期最常见的糖代谢异常类型之一。随着人们生活方式和饮食结构的改变,妊娠期糖尿病的发病率逐年增加。妊娠期糖尿病对母婴危害极大,其发生发展机制尚未完全明确。近年来,慢性炎症参与的胰岛素抵抗在妊娠期糖尿病发生发展中的作用受到广泛关注。Micro RNAs（mi RNAs）是一类长度为18-25nt的单链非编码RNA,它通过结合靶基因m RNA的3’UTR（untranslated region）而抑制基因的表达。今年来研究发现胎盘中特异性表达大量的mi RNA,称为胎盘特异性mi RNA（PS mi RNA）,mi R-518d是胎盘特异性mi RNA,mi R-518d在妊娠期糖尿病胎盘中高表达,且含量与GLUT1和GLUT4的m RNA含量及蛋白含量呈负相关,提示其可能通过抑制GLUT1和GLUT4的表达来影响葡萄糖转运以及胰岛素敏感性。有研究发现,mi R-518d表达与PPARα的表达呈负相关,生物信息学软件预测PPARα是mi R-518d的潜在的靶基因,提示mi R-518d可能通过PPARα参与妊娠期糖尿病的发生发展。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferators-activated Receptors,PPAR）是配体激活的核转录因子,广泛表达于机体各个组织,具有多种生物学效应。PPARα配体能通过负调节NF-κB和AP-1通路抑制辐射诱导的小神经胶质细胞的炎症反应。在视网膜色素上皮细胞和巨噬细胞中激活或上调PPARα能抑制脂多糖（LPS）诱导的NF-κB炎症通路,提示PPARα与NF-κB之间存在相关性。NF-κB为一个转录因子蛋白家族,在妊娠期糖尿病中可与TNF-α互相激活形成低度炎症的正反馈环,加重胰岛素抵抗,从而促进妊娠期糖尿病的发生发展。在妊娠期糖尿病的胎盘滋养细胞中PPARα是否能通过NF-κB激活炎症通路进而影响胰岛素抵抗,PPARα和NF-κB之间存在怎样的调节关系,mi R-518d对妊娠期糖尿病胎盘炎症反应的调节是否通过PPARα通路实现,解答这些问题有助于进一步阐明mi R-518d在妊娠期糖尿病发生发展中的作用机制。研究方法:1、收集正常孕妇、妊娠期糖尿病孕妇的相关临床资料和血液、胎盘标本,应用FISH、q RT-PCR、Western blot及ELISA方法分别检测mi R-518d、PPARα和炎症因子表达,分析其相关性以及对妊娠结局的影响;2、对人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo进行转染mi R-518d的模拟物或抑制物,同时给予PPARα拮抗剂处理,q RT-PCR、Western blot检测下游基因及炎症因子表达变化,利用生物信息学软件预测mi R-518d和PPARα的结合位点,并应用荧光素酶报告基因进行验证;3、给予8周龄C57BL/6J雌性小鼠高脂高糖饲料喂养,诱发其体重增加,结合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备GDM实验动物模型,模型建成后,雌鼠与雄鼠按2:1的比例合笼,次日晨检查阴道栓者记为妊娠0天,于妊娠第0、3、10、18天禁食12小时后,次日早晨对孕鼠称重。进行腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）,应用ELISA方法检测总胆固醇（CH）、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG）和胰岛素（INS）,在此基础上计算胰岛素抵抗的稳态模型（HOMA-IR）。在GDM组孕0天分别经鼠尾静脉给予mi R-518d拮抗剂及PPARα拮抗剂,第19天取胎盘组织,应用q RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测下游基因及炎症因子的表达。结果:1.对石蜡包埋的胎盘组织切片进行FISH分析,结果显示,mi R-518d在GDM患者胎盘组织中高表达;q RT-PCR及Western blot结果显示,mi R-518d在GDM患者胎盘组织中表达升高（P<0.05）,PPARα在GDM患者胎盘中表达降低（P<0.05）;应用Western blot和ELISA法检测外周血中炎性因子NF-B、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的含量,结果显示,NF-k B、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2在GDM组中表达升高（P<0.05）;通过统计软件SPSS分析mi R-518d表达水平与临床指征间的相关性,结果显示,两组孕妇年龄、孕周均无统计学差异,与对照组相比,mi R-518d高表达的GDM组孕妇BMI、胎盘重量及新生儿体重明显增高（P<0.05）。2、与生理浓度组比较,高糖组人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo炎性因子NF-B、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表达升高（P<0.05）;与高糖组相比,mi R-518d模拟物组炎性因子NF-k B、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表达升高（P<0.05）,mi R-518d抑制物组炎性因子NF-k B、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表达降低（P<0.05）。应用q RT-PCR和Western blot方法方法检测PPARα、CD36、ACO、UCP2 m RNA和蛋白的表达,结果显示,与高糖组相比,mi R-518d模拟物组PPARα、CD36、ACO、UCP2 m RNA和蛋白的表达下降（P<0.05）,mi R-518d抑制物组PPARα、CD36、ACO、UCP2 m RNA和蛋白的表达升高（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实PPARα是mi R-518d的靶基因。应用PPARα特异性拮抗剂和PPARαsi RNA干扰质粒转染HGI组细胞,通过q RT-PCR以及Western blot实验检测PPARαm RNA和蛋白质表达水平,结果显示,PPARαm RNA转录水平和蛋白质表达水平下降（P<0.05）,转录因子NF-κB和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2表达增加（P<0.05）。应用mi R-518d抑制剂和PPARαsi RNA干扰质粒转染HG组细胞,通过Western blot实验检测细胞核内NF-κB蛋白质表达,结果显示,与高糖组比较,高糖+mi R-518d抑制剂组细胞核内NF-κB表达水平降低（P<0.05）,高糖+mi R-518d+PPARαsi RNA组,细胞核内NF-κB表达水平升高（P<0.05）;与HG组比较,mi R-518d抑制剂可以抑制IKKβ和IκBα的磷酸化,同时抑制mi R-518d和PPARα,可以使IKKβ和IκBα的磷酸化得到加强。3、GDM造模成功,孕第10天和第18天,GDM组的体重显著高于正常妊娠组（P<0.05）,在GDM小鼠组内比较,第18天的平均体重显著高于第10天（P<0.05）。在IPGTT试验中,血糖水平在1小时左右达到峰值,然后开始下降,与对照组相比,GDM组的峰值更高（P<0.05）。与正常组相比,GDM组小鼠CH、TG、GLU水平升高（P<0.05）,INS水平降低（P<0.05）,导致HOMA-IR升高。对GDM组采用尾静脉注射,分别给予mi R-518d拮抗剂和PPARα抑制剂,RT-PCR和Western Blot检测各组PPARα及其下游基因表达,结果发现,与GDMMS组比较,在GDMMS组给予mi R-518d的拮抗剂后,PPARα、CD36、ACO及UCP2 m RNA和蛋白的表达升高（P<0.05）,GDMMS组加mi R-518d的拮抗剂,再给予PPARα拮抗剂后,发现PPARα、CD36、ACO及UCP2的表达有一定程度的下降（P<0.05）;应用ELISA方法检测血浆炎症因子表达变化,结果显示,与GDM组比较,mi R-518d拮抗剂组NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2的表达降低（P<0.05）,mi R-518d拮抗剂组+PPARα抑制剂组转录因子NF-κB和炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2的表达较mi R-518d拮抗剂组升高（P<0.05）;与GDM组相比,mi R-518d拮抗剂组细胞核内NF-κB转录水平降低,IKKβ和IκBα的磷酸化减少（P<0.05）,通过给予PPARα抑制剂可以一定程度逆转这种现象。结论:1、GDM患者的胎盘组织中mi R-518表达上调,PPARα表达下调,转录因子NF-κB和炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2表达上调,mi R-518的表达水平与孕妇BMI、胎盘重量及新生儿体重明显增高等临床特征相关。2、mi R-518d通过PPARα调控IKK-NF-κB/IκB信号通路影响下游基因表达及炎性因子反应。