论文部分内容阅读
背景:肿瘤细胞多药耐药性(Multidrug resistance, MDR)的产生,是目前肿瘤化疗失败的一个主要原因。耐药肿瘤细胞大多有P-gp(P-glycoprotein,P170糖蛋白)蛋白的高表达,作为具有外排泵功能的P-gp蛋白能够能量依赖性地排出包括化疗药物在内的多种底物,对于细胞凋亡等多种细胞生物学行为也有一定的影响,研究MDR的发生机制和有效的逆转MDR已成为肿瘤治疗急需解决的问题。传统的MDR逆转以抑制P-gp的药物为主,但是药物性MDR逆转剂的效率较低,而且毒副作用较大,临床应用难以达到有效的逆转浓度。因此,寻找一种高效、低毒逆转MDR的方法是十分必要的。目的:研究高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound -HIFU)逆转K562/AO2细胞MDR的效能,并与传统的MDR逆转剂维拉帕米(VRP)比较,初步探讨其逆转MDR作用机制,从而为克服肿瘤细胞MDR提供一种新的、有效的方法和思路。方法:①超声剂量学研究:固定超声辐照时间或超声声强,应用不同声强或辐照时间的HIFU辐照K562、K562/AO2细胞株后,应用荧光显微镜AnnexinⅤ/PI染色检测细胞的即刻以及48h凋亡情况,用台盼蓝、MTT法检测HIFU对肿瘤细胞的抑制率,了解HIFU剂量-效应关系。②将对数生长期的K562、K562/AO2细胞株分组为:阿霉素(ADM)组、ADM加HIFU辐照(剂量为400W/ cm2×5s)组(HIFU组)、ADM加维拉帕米组(VRP组)。各组分别用MTT法检测K562、K562/AO2细胞各组的抑制率,用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞内的ADM浓度, PI染色观察DNA含量的变化,用FCM和荧光显微镜AnnexinⅤ/PI染色检测各组细胞的凋亡情况。③免疫组化检测各组P-gp、PDCD5表达情况,并用Image-Pro Plus5.02软件定量分析。结果:①当辐照时间一定时(5s)声强越高肿瘤细胞存活率越低,当HIFU声强一定时(400 W/cm2)细胞存活率随HIFU辐照时间延长而下降, HIFU辐照剂量为400W/ cm2×5s时对K562、K562/AO2细胞的存活不产生明显影响,未观察到即刻和延迟的凋亡现象;②在K562细胞株中HIFU、VRP对细胞内ADM浓度没有明显影响,肿瘤细胞增值抑制率和凋亡率HIFU组、VRP组、ADM组各组之间比较P均> 0.05。在K562/AO2细胞株中HIFU、VRP均能提高K562/AO2细胞内ADM浓度,HIFU组、VRP组与ADM组比较P均<0.01, HIFU组与VRP组比较差异无显著性(P > 0.05)。HIFU组、VRP组、ADM组均能抑制K562/AO2细胞的增殖,HIFU组、VRP组与ADM组比较P均<0.01, HIFU组与VRP组比较差异无显著性(P > 0.05)。HIFU组、VRP组、ADM组均能使K562/AO2细胞发生凋亡,细胞周期分析S期细胞比例(SPF)降低,降低幅度HIFU组、VRP组高于ADM组(P均<0.05), HIFU组与VRP组比较差异无显著性(P > 0.05)。③免疫组化的Image-pro plus分析发现: P-gp在K562/AO2表达明显高于K562,HIFU辐照K562/AO2细胞后P-gp表达明显降低。PDCD5在K562/AO2表达明显低于K562,HIFU辐照后K562/AO2细胞PDCD5表达升高。结论:一定强度剂量的HIFU辐照耐药的肿瘤细胞可以提高化疗药物在耐药肿瘤细胞内的浓度,同时可以增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的增值抑制率和凋亡率。HIFU逆转MDR的可能机理是增加了生物膜对于化疗药物的通透性、下调耐药细胞的P-gp表达和上调PDCD5表达,从而改变了耐药肿瘤细胞的凋亡耐受状态,提高了耐药肿瘤细胞对细胞毒药物的敏感性,一定程度上逆转了MDR。虽然在效能比较上HIFU与VRP差异无显著性,但考虑到HIFU的无创、无毒、优良的体外可控性,可以认为HIFU是一种较为理想的MDR逆转方法。