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目的BRAF突变的结直肠癌预后较差,并且对目前治疗不敏感。结直肠癌BRAF（V600E）突变往往与微卫星不稳定型（MSI）相关,免疫检查点抑制剂对该类型结直肠癌具有一定疗效。最近的临床研究表明,抗PD-L1抗体仅对MSI突变型的结直肠癌有疗效。很少证据表明BRAF在肿瘤细胞中能起到免疫调节作用。DNA错配修复缺失的结直肠癌常发生BRAF突变,并对抗PD-1抗体有一定疗效。人们主要关注在肿瘤免疫治疗的肿瘤PD-L1与T细胞PD-1相互作用的机制问题上。最初的报道称肿瘤PD-L1可杀伤抗肿瘤的T细胞,而现在大部分关于PD-L1的研究主要集中于肿瘤细胞胞外的PD-L1与T细胞之间的相互作用。然而,最近的研究表明黑色素瘤PD-L1可能通过细胞内部结构来调节其细胞凋亡,并能通过激活蛋白激酶信号来改变细胞有丝分裂。而对结直肠癌PD-L1来讲,是否也具有调节肿瘤内部信号通路的能力及其调控抗肿瘤药物耐药的机制值得深入探究。方法1.TCGA数据库的基因表达分析,初步判断PD-L1与BRAF、KRAS、WT等结直肠癌之间的关系,是否具有显著差异。并在机制的探究中,我们利用该数据库,筛查PD-L1影响BRAF表达的信号分子,如c-JUN与YAP。同时,我们利用survminer数据库的生存率分析,并选取不同的cut-off值,观察PD-L1与PD-1基因是否会影响人类结直肠癌病人的生存曲线。2.利用Western Blot与RT-PCR技术,分析PD-L1的在人类结直肠癌细胞的表达水平,以及调控基因的表达情况。并利用MEK抑制剂药物对上游信号通路进行抑制,观察PD-L1的表达。同时,应用si RNA转染技术,通过降低YAP与c-JUN的表达,影响PD-L1的表达。3.通过CRISPR-Cas9技术构建PD-L1敲除结直肠癌细胞。应用抗PD-L1抗体、cobimetinib、奥沙利铂或伊立替康分别对结直肠癌细胞进行治疗,治疗时间为1-2天,证明其是否会影响DNA双螺旋链断裂（p H2AX）以及活化的caspase-3,并从转录与蛋白相互作用上探究其耐药机制。4.应用SCID鼠体内模型,验证PD-L1敲除的MC38细胞对奥沙利铂或伊立替康是否会影响其耐药性。结果1.我们通过TCGA数据库对RNA测序数据进行分析,发现PD-L1的m RNA在BRAFV600E突变肿瘤要比非BRAFV600E型中表达水平高。PD-L1的高表达水平与结直肠癌病人生存率较高有关,而PD-1的表达水平与结直肠癌病人生存率无关。该结论可能说明应用抗PD-L1抗体治疗结直肠癌的意义。2.在细胞水平上,我们发现增加BRAF或KRAS突变等位基因,或通过基因异位表达可以使细胞表面或转录水平上的PD-L1明显增高。我们利用cobimetinib药物抑制MEK/ERK信号通路,发现BRAF或KRAS突变能够诱导PD-L1表达下调,这与YAP与c-JUN共同调控PD-L1有关。3.BRAF诱导的PD-L1对化疗药物或蛋白酶抑制剂敏感性有一定的影响。与亲代的RKO（人类大肠癌）细胞进行比较,抗PD-L1抗体、cobimetinib、奥沙利铂或伊立替康所引起的DNA双螺旋链断裂（p H2AX）以及活化的caspase-3在PD-L1敲除的细胞中均有所降低。同时,我们利用MC38（鼠类大肠癌）细胞进行PD-L1敲除与再表达,PD-L1再表达的MC38细胞恢复了原有的DNA损伤与细胞凋亡功能,而PD-L1胞内或胞外片段的再表达则不会恢复亲代细胞的DNA损伤与细胞凋亡功能。敲除PD-L1所引起的抗肿瘤药物耐受性下降的机制与下调p-AKT和BH3蛋白家族（BIM与BIK）有关。再者,我们利用抗PD-L1抗体对RKO与MC38细胞进行干预,其也能降低p-AKT与BIM的表达,并降低伊立替康引起的细胞凋亡作用。因此,无论是PD-L1敲除的结直肠癌细胞还是应用抗PD-L1抗体的药物,其均可诱导BIM或BIK下降。4.在SCID鼠体内模型中,PD-L1敲除的MC38细胞对奥沙利铂或伊立替康能够产生耐药性,而PD-L1再表达的细胞对这两种药物的敏感性恢复。结论PD-L1能够提高结直肠癌抗肿瘤药物所诱导的细胞凋亡作用,而其抑制剂会引起化疗耐药性。该研究能够使人们对PD-L1功能的认识更加深刻,包括非免疫机制。同时,PD-L1可作为识别细胞毒性化疗药物敏感性的潜在生物标志物。