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目的:动物实验:通过探究转染DCN基因对成纤维细胞TGF-β1、Smad3、Smad7表达及细胞增殖的影响,探讨DCN基因对TGF-β1/Smads信号通路的调控作用机制。从而为药物通过调控DCN基因来干预气道重塑,延缓COPD病程发展提供理论依据。临床观察:前期课题研究发现,苗族人民常用的止咳、化痰苗药紫金牛、铁扫帚可以显著增加COPD大鼠肺组织中DCNmRNA表达量,对TGF-β1、Smad3、Smad7等信号分子有调控作用,并且可以明显缓解COPD大鼠呼吸道症状、改善COPD大鼠支气管肺组织病理改变。基于DCN调控TGF-β1/Smads信号通路对气道重塑产生的干预作用,在中医理论及苗医药理论指导下,应用对DCN有干预作用的紫金牛、铁扫帚对AECOPD(痰浊阻肺证)患者进行临床疗效观察。为筛选出具有延缓或者治疗COPD气道重塑作用的民族医药,做出前期探索。 方法:动物实验:选用健康SD雄性大鼠,采用熏香烟加气道内注入脂多糖(LPS)法构建COPD大鼠模型。将造模成功的COPD大鼠,取剔除内膜的气管,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞原代培养。传代培养至第三代的成纤维细胞用于转染实验。通过分子克隆的方式,构建携带DCN基因的真核表达质粒。质粒通过脂质体法转染入成纤维细胞。采用Real time PCR检测TGF-β1、Smad3和Smad7基因的表达变化;CCK-8法检测质粒转染成纤维细胞后对细胞增殖的影响。临床观察:符合标准的60例痰浊阻肺证AECOPD患者,采用随机、开放、对照试验,应用随机数值表法,按就诊先后顺序将患者随机分为对照组和苗药组。对照组:参照2015年GOLD慢性阻塞性肺疾病指南进行治疗;苗医组:对照组治疗基础上加用苗药紫金牛、铁扫帚煎剂。通过分析比对治疗前后患者证候评分变化,肺功能、血气分析、mMRC评分等变化,评估治疗效果。 结果:动物实验:经鉴定造模成功的COPD大鼠,取气道组织培养成纤维细胞,通过分离、纯化、鉴定,传代培养至第三代的成纤维细胞用于实验。通过成纤维细胞提取目的基因并进行扩增,目的基因及载体质粒通过双酶切,连接酶整合,携带目的基因的质粒扩增,经菌落PCR鉴定、双酶切鉴定、测序鉴定,目的基因质粒构建成功。通过对转染后的成纤维细胞进行Real time PCR检测、细胞增殖检测:转染组与对照组相比,DCNmRNA、Smad7mRNA表达量明显增加,而TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达量明显减少,差别均有统计学意义(P<0.05);空转染组与对照组以上检测指标检测无明显差异,差别无统计学意义(P>0.05)。通过对成纤维细胞增殖数目检测,在转染24h时,三组成纤维细胞数量并无明显差异,差别无统计学意义(P>0.05);在48h、72h时,转染组的成纤维细胞数目明显低于对照组成纤维细胞数目,差别具有统计学意义(P<0.05),而对照组与空转组在三个时段的成纤维细胞数目均无明显差异,差别无统计学意义(P>0.05)。临床观察:苗药组和对照组治疗前,两组在一般资料、证候评分、肺功能、血气分析、mMRC方面对比均无显著差异(P>0.05)。治疗后:苗药组与对照组两组患者相比,在气短、胃纳、腹胀方面对比,改善无显著差异(P>0.05);而在咳嗽、咳痰、喘息、胸闷、肺部啰音及最后总证候积分方面对比,苗药组较对照组改善有显著差异(P<0.05)。 结论:动物实验:通过转染DCN基因对COPD大鼠气道成纤维细胞影响的实验观测(TGF-β1、Smad3和Smad7基因的表达变化;质粒转染成纤维成纤维细胞后对细胞增殖的影响),得出以下推论:①DCN基因的大量表达可以直接抑制TGF-β1、Smad3表达,促进Smad7表达量。②DCN可能直接和TGF-β1、Smad3存在负反馈调节,DCN大量表达时,反馈性的抑制TGF-β1、Smad3表达。③DCN基因可能通过调控Smad7大量表达,使Smad7与TGF-β1结合,形成负反馈调节,减少TGF-β1、Smad3表达。④DCN可能与Smad7存在协同作用,DCN通过本身对TGF-β1的中和作用,阻断其信号传导,并且能通过调控Smad7表达,与Smad3形成竞争性抑制,进一步阻断TGF-β1信号传导,防止气道的过度修复。⑤DCN基因的高表达确实对成纤维细胞的增殖有抑制作用。TGF-β1可能通过TGF-β1/Smads信号通路促进成纤维细胞增殖;转染DCN基因对TGF-β1/Smads信号通路产生抑制作用,干预成纤维细胞增殖速度。临床观察:将苗药紫金牛、铁扫帚应用于临床观察,通过对苗药组及对照组两组,在证候积分、肺功能、血气分析、mMRC评分等指标比较,苗药组治疗效果明显优于对照组,差异具有统计学意义。基于DCN对TGF-β1/Smads信号通路的影响,推论苗药紫金牛、铁扫帚可能通过对DCN调控,对TGF-β1/Smads信号通路产生干预作用,起到干预气道重塑,改善病情的作用。