大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害,平均每年给全世界大豆生产造成10-20亿美元的经济损失,防控大豆疫霉根腐病最经济有效的方式是种植抗病大豆品种。大豆疫霉与大豆的互作符合“基因对基因”假说:当大豆疫霉携带无毒（Avr）基因而大豆携带对应的抗病受体（R）基因时,大豆R受体如果能特异性地识别疫霉菌Avr基因产物,就能为大豆提供对大豆疫霉的抗性。因此,研究大豆疫霉无毒基因的功能及其作用机制,不仅可以深入理解疫霉菌病害侵染机制,而且能为设计大豆疫病防控方法提供新的研究思路。本研究以无毒基因PsAvr3c为研究对象,通过一系列遗传、生化、细胞生物学实验并结合转录组测序等手段,发现PsAvr3c与植物可变剪切复合体中的一类新型调控蛋白GmSKRPs互作,从而大规模重编程寄主基因的pre-m RNA可变剪切抑制植物免疫。病菌无毒基因通常通过基因缺失、序列变异或者转录沉默等多种方式逃避植物抗病基因的识别,而PsAvr3c逃避抗病基因识别的分子机理尚不清楚。本研究通过定点突变结合群体序列分析发现PsAvr3c通过将第174位丝氨酸突变为甘氨酸,该位点的突变导致PsAvr3c和参与抗病激活过程中的GmSKRPs蛋白互作亲和度下降,从而逃避抗病基因Rps3c的识别。本研究较为系统地揭示了 PsAvr3c在大豆疫霉与大豆互作过程中的作用机理,具体内容如下:PsAvr3c是大豆疫霉的一个重要毒性因子。荧光定量PCR的实验结果表明PsAvr3c在侵染早期可以被诱导表达,这提示PsAvr3c可能在大豆疫霉侵染过程中起重要作用,那么PsAvr3c在大豆疫霉菌与大豆互作过程中是否具有促进侵染的毒性功能?本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得PsAvr3c的敲除突变体,突变体接种实验发现其在大豆黄化苗上的致病力显著减弱,这些结果表明PsAvr3c在大豆疫霉与大豆互作过程中发挥毒性功能。此外,在烟草叶片和大豆根毛中过表达PsAvr3c都可以促进疫霉菌的侵染,这些结果进一步证实PsAvr3c是大豆疫霉的重要毒性因子。利用Prosite在线软件预测分析发现PsAvr3c的蛋白末端含有一个核定位信号,细胞定位观察发现PsAvr3c依赖于该核定位信号定位到植物的细胞核中,进一步的疫霉菌接种实验证明PsAvr3c的细胞核定位对其发挥毒性具有重要作用,这些结果为深入研究PsAvr3c的毒性机理提供了宝贵的线索。PsAvr3c通过与GmSKRPs互作重编程寄主pre-mRNA的可变剪切进而抑制植物免疫发挥其毒性功能。为深入研究PsAvr3c发挥毒性功能的分子机制,本研究利用酵母双杂筛选大豆的cDNA文库发现PsAvr3c和大豆中的GmSKRP 1/2蛋白互作,并利用多种方法证实了 PsAvr3c和GmSKRP 1/2蛋白之间的互作,提示GmSKRPs是PsAvr3c的寄主靶标蛋白,另外烟草体内共注射结果也表明PsAvr3c可以稳定GmSKRPs的蛋白水平。大豆根毛中过表达GmSKRP1/2可以促进大豆疫霉的侵染,而沉默GmSKRP1/2可以提高大豆根毛对大豆疫霉的抗性,这些结果说明SKRP蛋白是植物抗疫霉菌的负调控因子。那么SKRP蛋白调控植物免疫反应的作用机制是什么?在烟草中瞬时表达GmSKRP1,利用免疫共沉淀技术结合蛋白质谱鉴定发现GmSKRPs是植物可变剪切复合体中的一类新型调控蛋白。转录组测序结果发现PsAvr3c和GmSKRPs共同调控401个大豆基因pre-mRNA的可变剪切,其中包括大量的免疫相关基因;PsAvr3c敲除突变体侵染实验以及PsAvr3c和GmSKRPs的过表达实验证实寄主植物防卫基因pre-mRNA剪切被病菌干扰是导致寄主感病的重要原因之一。该研究首次揭示了病原菌在RNA剪切水平上调控寄主免疫反应的一种新型致病机制。GmSKRPs蛋白磷酸化修饰和多聚体形成可能参与其负调控植物免疫的功能。GmSKRPs参与寄主的可变剪切过程,进而负调控植物免疫,但是SKRP蛋白参与可变剪切过程的分子机制尚不清楚。本研究通过生化实验证实GmSKRP1蛋白存在磷酸化修饰,将GmSKRP1中所有丝氨酸、苏氨酸和酪氦酸全部突变为丙氨酸构建了一个磷酸化丧失突变体GmSKRP1Pmut,发现在烟草中过表达该突变体不再促进辣椒疫霉侵染,推测GmSKRP1的磷酸化修饰参与其促进侵染的功能。此外,酵母双杂交实验结果还发现SKRP蛋白通过其蛋白末端一段保守的Monkey tail-like功能域互作形成同源聚合体,当删掉该功能域之后,SKRP蛋白无法自身互作也不能促进辣椒疫霉侵染,这一结果说明SKRP蛋白需要自身互作才能发挥毒性功能。通过对GmSKRP1过表达的大豆转录组样品的深入分析,发现GmSKRP1不仅可以调控核酸代谢、基因表达调控过程中相关基因的可变剪切还能直接影响NBS-LRR类抗病相关基因的可变剪切。这些发现为进一步研究SKRP蛋白的功能提供了重要的线索。PsAvr3c通过第174位氨基酸的变异逃避抗病基因识别。PsAvr3c等位基因在已检测的所有大豆疫霉菌株中都转录表达并且具有丰富的序列多态性,但是其通过序列变异逃避大豆抗病基因Rps3c识别的分子机制尚不清楚。大规模序列关联分析结合定点突变发现PsAvr3c中第174位丝氨酸突变为甘氨基酸是其逃避抗病基因Rps3c识别的重要原因。大豆叶片上瞬时表达PsAvr3c及其核定位信号突变体时发现只有当PsAvr3c定位在植物细胞核中时才能触发大豆抗病基因Rps3c介导的抗性,说明PsAvr3c的细胞核定位是其触发免疫所必需的,但是第174位的氨基酸的突变并不影响PsAvr3c的细胞核定位模式。为进一步阐明该突变的生物学意义,通过酵母双杂和体内免疫共沉淀发现第174位的氨基酸突变导致PsAvr3c与GmSKRPs的互作亲和度显著减弱,由此猜测GmSKRPs蛋白参与Rps3c识别PsAvr3c的过程。在含Rps3c的大豆叶片上特异性沉默GmSKRPs导致PsAvr3c引起的细胞死亡显著减弱。以上结果表明PsAvr3c通过关键位点突变的方式,降低与GmSKRPs的结合强度,从而逃避寄主抗病基因Rps3c的识别。