乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是全世界女性癌症相关死亡的主要原因。从90年代以来,中国乳腺癌发病率的增长速度是全球的两倍多。现今,对于乳腺癌的防治至关重要。乳腺癌的形成、增殖和转移与其它恶性肿瘤一样,是多基因、多因素共同作用的结果。除了遗传、年龄、月经史、婚育史等已知具有确定性的危险因素外,流行病学研究表明,肥胖和高脂肪饮食与乳腺癌的发生发展密切相关,不仅是乳腺癌的危险因素,还与不良预后相关。说明乳腺癌的发生发展与机体脂代谢密切相关。肿瘤细胞无节制的分裂增殖,导致其对能量和大分子需求的增加。为了满足这些需求,肿瘤细胞的代谢必然会发生重大改变。脂肪酸（Fatty acid,FA）合成增强,是肿瘤细胞一个标志性的代谢改变。肿瘤细胞持续分裂增殖需要新合成大量细胞膜,而FA是合成膜磷脂的基本原料砌块,FA还能为肿瘤细胞提供能量支持,此外,FA还用于合成一系列促癌脂质信号分子。从头合成是肿瘤细胞获得FA的主要方式。近年来靶向脂代谢的抗肿瘤研究主要集中于脂肪酸合成酶（FAS）。而FA从头合成的产物为饱和FA（SFA）,由其构成的生物膜流动性低,会影响细胞的基本功能,包括信号转导和基因表达。此外,SFA的累积对细胞具有脂毒性。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）是催化SFA转化为单不饱和脂肪酸（MUFA）的关键酶,可以认为SCD1是FA合成途径中最终步骤的限速酶。在肿瘤细胞中,异常活跃的SCD1使SFA不断转化为MUFA,不仅避免了因SFA累积引起的脂毒性,而且MUFA才是生物膜结构的主要成分,可通过酰化作用形成以磷脂质为主的膜脂质,MUFA在肿瘤细胞的膜结构和膜功能中发挥着更为重要的角色。在脂肪肝、糖尿病、肥胖和某些肿瘤患者中均发现SCD1表达水平异常升高,SCD1可能与脂代谢紊乱有着密切的联系,可能是多种疾病发生发展的枢纽。乳腺是一个富含脂肪组织的器官,癌变的乳腺导管或腺体细胞就嵌入在脂肪细胞之间。研究显示,脂肪细胞参与了肿瘤细胞之间的信息交互,脂肪细胞和癌细胞“养活”彼此,一起创造一个共生的环境。然而,脂肪细胞与癌细胞的相互作用机制尚未完全阐明。有研究表明,脂肪细胞能通过向卵巢癌细胞提供FFAs,向白血病细胞提供谷氨酰胺,促进其发生发展。脂肪细胞能通过脂肪动员产生大量的长链FA（LCFA）,而LCFA被肿瘤细胞摄取利用需要膜蛋白介导。CD36,又称为脂肪酸转位酶（FAT）,是一种跨膜蛋白,能结合并富集细胞膜外的（外源性）LCFAs,协助FA穿过细胞膜。CD36是肿瘤细胞摄取FA的主要膜蛋白。因此我们推断,仅抑制FA合成可能对乳腺癌细胞效果欠佳,外源性FA可能减弱抑制FA从头合成取得的抗肿瘤效果,而同时抑制FA合成和摄取才能达到稳定的抗肿瘤效果。SCD1不仅调控着细胞的脂质合成,而且在肿瘤细胞存活并维持恶性表型中也起着重要作用。然而,SCD1同时调节脂质代谢和肿瘤细胞生物学特征的复杂机制尚未完全阐明。细胞生长和增殖取决于合成代谢和分解代谢相互调节。在哺乳动物细胞中,两个主要的信号蛋白Akt和AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）调控着多个关键的生物合成和分解代谢反应。脂质合成过程也受到Akt和AMPK的调节。因此,我们进一步探讨Akt和AMPK两条信号通路在SCD1促乳腺癌细胞增殖中的作用机制,为靶向脂代谢的抗肿瘤治疗提供新的方向。第一部分MF-438抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长增殖以及油酸的逆转作用目的:研究SCD1抑制剂MF-438对乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响,为乳腺癌的治疗寻找新的靶点。方法:分别在正常血清（10%FBS）、低血清（2%FBS）以及在低血清培养基中添加不同浓度的油酸（OA）或棕榈酸（PA）的条件下,应用100nM¹00μM浓度范围的MF-438干预MCF-7细胞48h,应用MTS法测定细胞增殖抑制率,计算不同培养条件下MF-438的IC₅₀值。用5μM MF-438在含或不含100μM OA培养条件下干预MCF-7细胞株48h,应用Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞形态,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞术分析细胞周期,划痕试验评估细胞的迁移能力。对比是否添加外源性OA的情况下,MF-438对MCF-7细胞作用的变化。结果:1不论是在正常血清还是低血清培养条件下,MF-438在100n M-100μM浓度范围内,对MCF-7细胞均显示出显著的剂量依赖性增殖抑制作用。在降血清培养下,MF-438的IC₅₀值明显降低（2%FBS 3.7μmol/l vs.10%FBS 16.7μmol/l）。培养基中添加OA对MF-438的生长抑制作用显示出了剂量依赖性的逆转作用,而添加PA进一步增强了MF-438的生长抑制作用。2 Hoechst33342荧光染色及PI染色流式细胞术检测发现,MF-438作用下的MCF-7细胞表现出典型的细胞凋亡特征性变化,细胞凋亡率显著增高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。当培养基中加入OA后,凋亡细胞数量明显减少,凋亡特征性变化减轻,凋亡率降低。3 MF-438干预后,MCF-7细胞中S期和G2/M期细胞比例显著减少,G0/G1期比例增加,与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。当培养基中加入OA后,MF-438的细胞周期阻滞作用基本上均被逆转,各期细胞比例与对照组相比差异无统计学意义。4 MF-438处理组的划痕,在24h及48h均宽于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。当添加OA后,与MF-438单独处理组相比,划痕在24h及48h均显著变窄,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1 SCD1活性抑制对MCF-7细胞产生明显的生长抑制作用,使MCF-7细胞分裂增殖时不能通过细胞周期的早期阶段,诱导细胞凋亡,并降低细胞的迁移能力,从而产生显著的抗肿瘤作用。2外源性OA能明显逆转由SCD1抑制导致的抗肿瘤作用。第二部分CD36沉默阻止了油酸逆转MF-438产生的抗肿瘤作用目的:研究敲低CD36后,SCD1抑制剂对乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响,探讨乳腺癌细胞获得FA的途径,以期通过阻断肿瘤细胞FA的来源,达到稳定持久的抗肿瘤效果。方法:制作乳腺癌组织芯片,应用免疫组化方法检测人乳腺癌标本和癌周正常乳腺组织中的SCD1和CD36蛋白的表达情况。细胞实验,首先应用针对人CD36的siRNA转染MCF-7细胞,并检测转染效率。分别在MCF-7细胞及CD36敲低的MCF-7细胞培养基中加入OA,应用油红O染色观察两组细胞内脂滴含量的变化。分别在siRNA-CD36转染的MCF-7细胞的培养基中加或不加100μM OA,用不同浓度MF-438干预48h后,应用MTS法测定每组的细胞增殖抑制率。分别在培养基中添加或不添加100μM OA,应用5μM MF-438干预CD36敲低的MCF-7细胞48小时,应用Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞形态,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞术分析细胞周期,划痕试验评估细胞的迁移能力的变化。结果:1 SCD1在绝大多数乳腺癌组织标本中表现为中-高度表达,并且为弥漫性胞浆染色,而在癌周正常乳腺组织中低表达或不表达。CD36在部分乳腺癌标本上呈现胞膜染色,部分乳腺癌表现为胞浆染色,少部分乳腺癌CD36呈低表达,癌周正常乳腺组织不表达。2降血清培养的MCF-7细胞内红色脂滴含量明显减少,添加OA后胞浆中的脂滴含量显著增多,而在CD36敲低的MCF-7细胞培养基中添加OA并未发现胞浆脂滴含量的明显增多。3在CD36敲低的MCF-7细胞中,MF-438仍表现出剂量依赖性的细胞增殖抑制作用,但较MCF-7细胞相比,CD36敲低的细胞活性稍有降低。在CD36敲低的MCF-7细胞中,添加外源性OA并未明显减弱MF-438的生长抑制作用。4 Hoechst33342荧光染色及PI染色流式细胞术检测显示,不论培养基中是否添加了OA,大多数CD36敲低的MCF-7细胞均表现出典型的细胞凋亡特征性变化,细胞凋亡率明显增高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。当培养基中加入OA后,凋亡细胞数量较MF-438单独作用组未见明显减少,差异无统计学意义（P>0.05）。5 MF-438作用下,CD36敲低的MCF-7细胞中S期和G2/M期细胞比例显著减少,G0/G1期比例增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。培养基中外源性OA的添加,并未改变MF-438的细胞周期阻滞作用,细胞周期中各期细胞比例较未添加OA组差异无统计学意义（P>0.05）。6 MF-438干预CD36敲低的MCF-7细胞,划痕在24h及48h均宽于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。培养基中添加OA,并未改变MF-438对CD36敲低的MCF-7细胞的迁移抑制,与MF-438单独应用组相比划痕宽度在24h及48h均无明显变化,差异无统计学意义（p>0.05）。结论:1乳腺癌MCF-7细胞能通过CD36介导外源性FA的摄取,作为FA从头合成的替代来源,维持自身的增殖需求。2当CD36基因沉默后,SCD1抑制剂的抗肿瘤作用在抑制MCF-7细胞生长增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进展、抑制细胞迁移各个方面,就不能被外源性OA所逆转。3 SCD1抑制联合CD36沉默对乳腺癌MCF-7细胞具有协同抗肿瘤作用。第三部分MF-438通过Akt和AMPK通路抑制乳腺癌细胞生长增殖目的:研究Akt通路和AMPK通路在SCD1抑制剂对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制中的作用,探讨SCD1在乳腺癌中的作用的机制。方法:应用5μM SCD1抑制剂MF-438干预MCF-7细胞48h后,采用Western blot技术检测总Akt、p Akt及脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1的表达。同样条件下采用Western blot技术检测p AMPK及其下游靶蛋白pACC的表达。结果:1 MF-438干预后,与对照组相比,pAkt及SREBP-1的表达均明显下降,pAkt与总Akt的比值降低约59%,SREBP-1下降38%,差异均有统计学意义（P<0.05）。在培养基中添加OA后,与MF-438单独应用组相比,pAkt的表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而添加PA后pAkt的表达水平进一步降低,但差异无统计学意义（P=1.00）。2用MF-438干预后,与对照组相比,pAMPK水平升高约65%,pACC水平增加约74%,差异有统计学意义（P<0.05）。在培养基中添加OA后,与MF-438单独应用组相比,pAMPK和pACC的水平显著降低（P<0.05）。而外源性PA的添加并未明显改变pAMPK和pACC的水平。结论:1在乳腺癌MCF-7细胞中,SCD1抑制剂通过下调Akt磷酸化水平抑制Akt通路,下调核转录因子SREBP-1的表达,从而下调FA合成。外源性OA能逆转抑制SCD1导致的Akt磷酸化水平的降低,从而增加Akt磷酸化水平激活Akt通路,促进细胞增殖和存活,而PA则具有相反的作用。2在乳腺癌MCF-7细胞中,SCD1抑制剂通过诱导AMPK磷酸化活化AMPK通路,催化ACC磷酸化失活,从而下调FA合成。外源性OA通过降低AMPK的磷酸化,诱导ACC去磷酸化活化,恢复FA合成,从而部分逆转抑制SCD1导致的FA合成下降。而PA进一步降低FA合成并增强细胞毒作用,但并未明显改变pACC及pAMPK的表达水平。