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目的:本研究通过车前草对动脉粥样硬化(AS)炎症反应的初步临床观察,探讨其抗炎作用的主要活性成分;并进一步对大车前苷(plantamajoside,PMS)通过PTEN/AKT/GSK3β信号通路改善ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎症反应和功能障碍的作用机制加以研究。方法:1.临床观察:收集经筛选合格的动脉粥样硬化(AS)患者病例11例及非AS病例5例。AS患者在标准治疗的基础上联合车前草治疗,治疗周期为两周,观察治疗前后AS患者IL-1 β、MCP-1、TNF-α水平;同时与非AS患者的相关指标进行对照。2.实验研究:利用CCK8检测不同剂量PMS处理的HUVECs的细胞活性,筛选出PMS对HUVECs生长不产生显著影响的浓度;制备ox-LDL诱导的血管内皮损伤的动脉粥样硬化的细胞模型,考察PMS对ox-LDL诱导后的HUVECs细胞活性和炎性的作用;探讨PMS在改善ox-LDL诱导的HUVECs的炎症反应和氧化应激及细胞凋亡的可能机制。结果:1.临床观察我们在车前草治疗2周后用ELISA法测定结果显示.:AS患者血浆中IL-1β、MCP-1、TNF-α水平较治疗前降低(尤其是MCP-1呈显著下降,P=0.0322);UPLC-QTOF-MS测试分析,在服用车前草的AS患者血浆中检测到大车前苷;提示车前草可能通过大车前苷抑制了 AS患者体内的炎症反应。2.实验研究(1)大车前苷的生物学活性作用研究 结果显示PMS可抑制细胞活性,且存在浓度依赖性关系,在高浓度1OOμM、200μM可显著抑制细胞的活性,与OμM(control)组比,存在统计学差异,提示高浓度的PMS存在HUVECs毒性,因此进一步研究时,选择<10OμM的PMS进行进一步研究,即20μM、40μM和80μM。(2)PMS对ox-LDL诱导后的HUVECs细胞活性和炎性的作用研究结果显示,与control组相比,ox-LDL组可显著抑制HUVECs的活性,增加细胞的凋亡,上调IL-1β、MCP-1和TNF-α的表达,增高ROS释放,抑制NO释放,增高MPO,降低SOD、IκB-α(Ser32)磷酸化水平和细胞核中NF-κκBp65表达水平,LOX-1、ET-1、Bax、cleaved caspase-3和PTEN表达水平均显著增高,eNOS(Ser113)、AKT(Ser473)和GSK3β(Ser9)的磷酸化水平和细胞质中NF-κBp65及细胞总蛋白中IκB-α和Bcl-2表达水平均显著下调,提示ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的动脉粥样硬化的细胞模型制备成功。进一步采用20～80μMPMS进行干预,可显著提高HUVECs的活性,抑制细胞凋亡,下调IL-1β、MCP-l和TNF-α的表达,降低ROS释放,增高NO释放,降低MPO,提高SOD、IκB-α(Ser32)磷酸化水平和细胞核中NF-κBp65 表达水平,LOX-1、ET-1、Bax、cleaved caspase-3 和 PTEN 表达水平均显著降低,eNOS(Ser113)、AKT(Ser473)和GSK3β(Ser9)的磷酸化水平和细胞质中NF-κBp65及细胞总蛋白中IKB-α和Bcl-2表达水平均显著上调,且具有浓度依赖性关系,提示PMS具有改善ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的动脉粥样硬化的作用,其中80μM的改善效果最显著。(3)大车前苷(PMS)通过PTEN/AKT/GSK3β信号参与ox-LDL诱导的HUVEC的炎性和氧化应激及细胞凋亡的作用 研究结果显示,与ox-LDL组比,给予AKT抑制剂(LY294002),AKT(Ser473)磷酸化表达明显降低,从(2.09±0.03)降至(1.17±0.03),给予 PTEN抑制剂(SF1670),PTEN 表达明显降低,从(0.58±0.03)降至(0.43±0.02),对应的 GSK3β(Ser9)也显著降低,从(2.27±0.04)降至(2.09±0.07)及(1.12±0.09),可见使用工具药已达到分段抑制PMS调节PTEN/AKT/GSK3β信号通路的目的。进一步地,加入AKT抑制剂(LY294002)可以逆转PMS对HUVECs活性增强作用,逆转PMS对细胞IL-1β、MCP-1和TNF-α的下调作用,逆转PMS对ROS的下调作用,逆转PMS对SOD的上调作用;加入PTEN抑制剂(SF1670)后,可以促进PMS对细胞IL-1β、MCP-1和TNF-α的下调作用,促进PMS对ROS的下调作用,促进PMS对MPO的下调作用,由上述结果在上述基础上验证了 PMS通过调节PTEN/AKT/GSK3β信号通路而达到改善ox-LDL诱导的HUVEC损伤与炎症反应,且该效应呈浓度依赖性关系。结论:1.车前草能抑制AS患者体内的炎症反应;PMS可能是其发挥作用的主要活性成分。2.大车前苷通过PTEN/AKT/GSK3β信号通路改善ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎症反应和功能障碍。