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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种条件致病菌,可引起许多严重的急性和慢性感染,如肺炎、感染性休克等。除此之外,铜绿假单胞菌还是一种可导致高蛋白食品诸如肉类腐败变质的腐败菌。研究表明,铜绿假单胞菌是冷鲜猪肉腐败的指示菌。在食品方面,铜绿假单胞菌的检测还是以传统微生物培养法为主,该法耗时较长且检测效率不高,已不太适用于高速发展的现代化企业。现如今,简单、快速的检测技术已成检测行业的必然需求。环介导等温扩增技术(Loop-meditated Isothermal Amplification,LAMP)是一种等温核酸扩增技术。与其他核酸扩增技术相比,其具有简单、不依赖昂贵检测设备的优点。因此本研究拟选用环介导等温扩增技术为检测方法,对从腐败的冷鲜猪肉中分离出来的肉源性铜绿假单胞菌进行快速检测,并与传统PCR检测方法进行对比。具体研究结果如下:1本论文从反应温度、反应时间、镁离子浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶量、内外引物浓度及比例等方面对肉源性铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法的反应条件及反应体系进行优化,最后确定最优反应体系为10×ThermoPol缓冲液2.5μL、MgSO4(100mM)0.5μL、dNTPs(10mM)1.0μL、FIP和BIP混合液(20μM)1μL、F3和B3混合液(5μM)1μL、Bst 2.0 DNA聚合酶大片段(4000U/mL)酶量4U、DNA模板1μL,无菌水补足至25μL。反应温度68℃、反应时间40min,80℃失活10min终止反应。2在使用kit法和煮沸裂解法提取的纯培养铜绿假单胞菌DNA作为扩增模板时,LAMP和PCR均有较好的特异性。在直接使用铜绿假单胞菌菌液作为扩增模板时,LAMP不能成功扩增,PCR仍具有较好的特异性。.在使用kit法提取的铜绿假单胞菌DNA作为扩增模板时,LAMP方法灵敏度为4.48 pg/μL,PCR方法灵敏度为44.8 pg/μL。在使用煮沸裂解法提取的铜绿假单胞菌DNA作为扩增模板时,LAMP方法灵敏度为4.48 pg/μL,PCR方法灵敏度为44.8 pg/μL。在直接使用铜绿假单胞菌菌液作为扩增模板时,LAMP不能成功扩增,PCR方法的灵敏度为2.2×10~4 CFU/mL。~13在使用kit提取的人工污染冷鲜肉中的DNA作为扩增模板时,LAMP方法表现出较好的特异性且检出限为1.9×10~2 CFU/mL,相当于1.9×10~4 CFU/g(PCR方法检出限为1.9×10~4 CFU/mL)。在使用煮沸裂解法提取的人工污染冷鲜肉中的DNA作为扩增模板时,LAMP方法依然表现出较好的特异性且检出限为1.9×10~3 CFU/mL,相当于1.9×10~5 CFU/g(PCR检出限为1.9×10~4 CFU/mL)。优化后的肉源性铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法在人工污染冷鲜肉样品的检测中,灵敏度比PCR法高10~100倍。4在对随机购买的11份市售冷鲜肉样品进行检测,LAMP的检测结果与传统微生物培养法和PCR法结果一致。综上所述,本研究所优化的肉源性铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法与常规PCR检测方法相比,具有灵敏度高、不需要昂贵的检测设备的优点.该方法具有应用至冷鲜猪肉检测的潜力,同时也为铜绿假单胞菌快速检测技术研究提供新的思路。