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研究目的:骨质疏松是一种代谢类疾病,主要是由于破骨细胞主导的骨吸收大于成骨细胞主导的骨形成造成的。已有研究表明运动可有效的促进骨生成抑制骨吸收,进而起到防治骨质疏松的作用,但其机制尚未完全明确。机体中的成骨细胞来源于BMSCs,BMSCs是具有多能分化潜能的干细胞,在体外适宜的环境下可分化为成骨细胞。细胞、细胞膜、细胞基质三者构成的结构可进行力的传导,使细胞外信号(机械力)转导为细胞内信号。BMSCs可感受体内多种机械刺激,对BMSCs成骨分化进程进行调控。人类基因组中编码基因只有2%,而其中的91%的基因序列转录为非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)。一种长度超过200 nt的ncRNAs,占ncRNAs总量的80%以上,它们不直接参与蛋白质的编码,称为长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lcnRNA s)。LcnRNA s可通过调控染色质重构、DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA聚合酶的活性来调节细胞的增殖和分化过程。其中lncRNA H19(long non-coding RNA H19,lcnRNA H19)是一种分子量为2.3 kb的lncRNA,位于人类染色体端粒区11p15.5的长链非编码RNA。研究发现lcnRNAs可通过Wnt/β-catenin、BMP等骨代谢信号通路来调节RUNX2、OCN、ALP等成骨分化相关基因的转录,进而影响成骨分化。因此本文通过对BMSCs进行机械牵张,以探究机械牵张应力对lncRNA H19及其下游通路的影响,为进一步探究运动防治骨质疏松的作用机制提供理论依据。研究方法:1.小鼠原代骨髓间充质干细胞提取及培养选取生长期C57BL/6小鼠,麻醉后处死,放置在75%酒精浸泡2分钟后,使用手术剪将肌肉、韧带和肌腱与股骨胫骨和肱骨分离,并转移到无菌纱布上,去除残留的软组织;将剥离干净的骨头转移到100mm无菌培养皿中,加入10ml完全的α-MEM培养基,所有的骨头在30分钟内处理完;使用含有1%青霉素/链霉素的PBS冲洗骨头,然后转移到新的含有完全培养基的100mm的无菌培养皿中,用镊子夹取骨头中间部位,使用解剖剪将骨髓腔末端切除,使用1毫升注射器,吸取培养基后,插入骨髓腔中,将骨髓慢慢冲洗出来,直到骨头变白,将培养皿放在37℃、5%二氧化碳培养箱培养;细胞融合70~90%,按照1:2--1:3比例进行传代。2.机械牵拉方案将传至第3代的C57BL/6小鼠原代BMSCs以1×10~5/ml接种到BioFlex 6孔板,细胞长至80%左右后使用Flexcell-5000细胞牵张仪对细胞进行牵张干预,对照组静置培养,其中牵张组分为:(1)1天牵张组,采用3%牵张强度,0.5 Hz,机械牵拉1天,干预时间为2h和4h,对照组静置培养,1天机械牵张干预结束后收集细胞。(2)7天隔天牵张组,采用3%牵张强度,0.5 Hz,机械牵拉7天,干预时间为2h和4h,即第1,3,5,7天干预,对照组静置培养。每48小时更换培养液,第7天机械牵张干预结束后收集细胞。3.指标检测采用Real-time PCR检测:lncRNA H19的表达;与lncRNA H19相关的microRNA(miR-675-3P,miR-675-5P,miR-22和miR-141)的表达。通过Real-time PCR与Western blot检测成骨相关基因(ALP,RUNX2,Osterix,OCN)及蛋白(wnt1,β-catenin)的表达。研究结果:1.1天牵张干预对BMSCs成骨分化中的lncRNA H19的表达无明显的促进作用;2.7天隔天牵张更有效的促进lncRNA H19表达。此外,7天隔天牵张4h组与对照组比较,显著促进lncRNA H19表达(P<0.01);3.7天隔天牵张更有效的促进lncRNA H19相关microRNA的表达。2h和4h的隔天连续7天的机械牵张应力使miR-675-5P含量增加,同时4h的牵拉刺激使miR-22和miR-141表达量下降(P<0.05);4.7天隔天牵张更有效的促进成骨分化相关基因及蛋白的表达。其中7天连续隔天的4h机械牵张应力使ALP,Osterix及RUNX2的表达量增加(P<0.01),其中2h连续性机械牵张应力使Osterix及RUNX2的表达量增加(P<0.01)。其中Western blot结果显示,4h与对照组和2h组中β-Catenin蛋白的表达显著性增加,但是机械牵张组Wnt1的表达无显著性。研究结论:1.机械牵拉促进BMSCs向成骨分化,且7天效果优于1天牵拉组2.7天牵拉组lcnRNA H19及其下游信号通路发生改变,这表明机械牵张可能通过“lcnRNA H19—microRNA—靶基因”调控骨髓间充质干细胞向成骨分化。