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目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种心血管系统的炎症性疾病,炎症反应贯穿于AS的整个病理过程。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是细胞外基质的一种粘附性蛋白，可由增殖活跃的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）合成和分泌，具有诱导细胞粘附及迁移的作用。此外，OPN还具有类细胞因子的作用，参与炎症反应。在AS发生发展过程中，OPN发挥着重要作用。本实验以抗OPN抗体为药物通过静脉给药阻断血管损伤部位OPN的功能，观察了对AS的防治作用，并对其作用机制进行了初步探讨。方法：1. 动物模型的建立及分组：将12只SD大鼠随机分为两组,模型组和预防组，每组6只。模型组，连续三天灌胃给予VitD3（总量为50万单位/kg），之后用高脂饲料以15g/只/天喂养21天。预防组，在给予VitD3灌胃和高脂饲料的同时，经尾静脉注射抗OPN单克隆抗体（滴度为1：1000），其用法为：0.5ml/次，隔日一次，共7次。实验前及实验后分别测大鼠的体重。每次注射抗OPN抗体后0、2、4、6、8、10、12小时及24小时测肛温。实验中观察大鼠的一般情况。两组动物分别于实验前及实验开始后10天、17天及24天取血，分离血清，用于C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Ca2+含量的测定，并于最后一次取血后将大<WP=4>鼠处死，留取主动脉血管进行病理切片、平滑肌α-肌动蛋白(SM-αactin)免疫组化染色、OPN Western印迹和组织Ca2+含量的测定。2. SM-αactin免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡，微波抗原消化5min。封闭液室温孵育10min。加入1:1000稀释的特异性SM-αactin单抗（阴性对照用PBS代替），湿盒4℃过夜。继而依次与生物素标记的二抗（1:1000稀释）和辣根酶标记的链霉卵白素于37℃孵育15min。用DAB显色。3. OPN Western印迹分析：取对照组和预防组大鼠主动脉蛋白提取液进行SDS-PAGE，电印迹转至硝酸纤维素膜上，依次与一抗、二抗进行结合反应，Western印迹结果用凝胶成像分析系统进行定量分析。4. 血清及组织Ca2+含量的测定：用全自动生化分析仪测定，具体操作按试剂盒说明书进行。5. 血清中炎性因子含量的测定：采用免疫浊度法测定CRP含量，用放免平衡法测定TNF-α含量。结果：1. 一般情况的变化：实验前后两组大鼠的体重基本上无多大变化，两组间无明显差异。预防组大鼠前四次尾静脉注射抗OPN抗体后，体温在8小时之内升到最高，达38.4±0.14℃（P<0.05），之后体温下降，从12小时到24小时，体温基本降至正常范围内。后三次注射抗体后，体温不再出现升高的现象。整个实验过程中，模型组大鼠的体温在正常范围内波动。两组大鼠的一般情况良好。2. 形态学变化：主动脉切片显示，模型组可见血管内皮下间隙增宽，内含小空泡，有些部位可见大空泡；中膜VSMC<WP=5>增生，排列紊乱或隆起，中膜弹性膜紊乱、断裂；有些部位有明显的钙化形成，钙化区周围可见到泡沫细胞。预防组仅见少许泡沫细胞分布于病变部位；中膜VSMC排列也较紊乱，但增生较轻；弹性膜轻度紊乱、偶见断裂；钙化区较少且不明显，未见到大空泡的形成。结果提示，预防组的病变程度较模型组轻。3. 血管壁中VSMC表型标志蛋白的表达变化：SM-αactin是分化型VSMC的标志蛋白。免疫组化结果表明，模型组血管壁中阳性染色颗粒较预防组少，而且着色也较淡。OPN是去分化型VSMC的标志蛋白。Western印迹分析表明，模型组OPN的表达量是预防组OPN表达量的1.2倍。SM-αactin的变化与AS病变程度成反相关，而OPN的表达量与AS病变程度成正相关。上述结果提示，AS病变部位的部分VSMC由分化型变为去分化型，导致SM-αactin合成减少，OPN合成增加。给予抗OPN抗体后，通过中和动脉壁损伤部位的OPN，在一定程度上抑制了VSMC表型转化，起到减缓AS进展的作用。4. 血清及组织Ca2+水平的变化：模型组和预防组10天时的血Ca2+水平显著升高（P<0.05），随着时间的延长，两组的血Ca2+含量又呈下降的趋势，17天和24天的血Ca2+均比实验10天时的血清Ca2+低并有显著性差异（P<0.05）；在相同时间点两组间的血Ca2+含量，均无差异（P>0.05）。此外，两组间血管壁组织中Ca2+含量比较也无统计学意义（P>0.05）。由此推测，实验初期，血钙的明显升高与大剂量的VitD3所致的骨钙动员和钙吸收增加有关。5. 血清中炎性因子含量的变化：CRP和TNF-α是早期<WP=6>炎症反应的两种较为敏感的指标，本实验观察到，随着实验天数的增加，模型组和预防组大鼠血清CRP含量均急剧上升。与实验前相比，实验开始后10天、17天以及24天的CRP含量均明显升高（P<0.05）。各时间点之间的CRP含量有显著性差异（P<0.05）。模型组和预防组大鼠各时间点TNF-α水平变化均不明显（P>0.05）。在同一时间点，两组之间的CRP和TNF-α含量比较均无差异（P>0.05）。提示，TNF-α并非是AS病变部位的主要炎性因子。抗OPN抗体可能主要通过局部作用来减缓病变进展的。结论：OPN作为AS病变部位合成和分泌的一种炎性因子，在AS发展过程中具有多方面的作用。以抗OPN抗体作为抑制剂，通过阻断OPN的作用，可达到缓解AS病变进展的目的。本研究为开发新的抗OPN制剂提供了实验依据