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研究目的:根据前期实验方法,在无菌环境下制备载VEGF和万古霉素的微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖可塑性微球型支架,与BMSCs共培养,进一步探究该支架对BMSCs增殖、成骨活性以及黏附性的影响,为该新型支架走进临床奠定前期基础。研究方法:1.采用全骨髓贴壁筛选法,从SD大鼠双侧股骨和胫骨分离培养出原代BMSCs,连续传代至第3代,对其进行成骨诱导,成脂诱导以及后续实验。2.按照前期实验方法,在无菌环境下制备载VEGF的海藻酸钠/壳聚糖多层缓释微球,将该微球加入载万古霉素的微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖混合基质内,构建无菌的载VEGF和万古霉素的微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖可塑性微球型支架。3.将该支架与BMSCs共培养,采用MTT法检测微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖支架对BMSCs增殖活性的影响;检测支架钙离子释放情况,成骨诱导后BMSCs茜素红染色、ALP染色和ALP活性表达程度,结合Real-time PCR检测在成骨诱导后BMSCs的ALP、BMP2、OPN和Runx2成骨相关基因转录情况,综合评价支架对BMSCs成骨活性的影响;将BMSCs接种到支架,24小时后DAPI染色液处理细胞,激光共聚焦显微镜观察共培养体系中细胞附着情况。研究结果:1.从SD大鼠双侧股骨和胫骨中成功分离培养出长梭形的BMSCs,经成骨诱导后可见钙结节,成脂诱导后可见脂滴。2.无菌环境下成功制备出搭载VEGF和万古霉素的微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖可塑性微球型支架,形态良好。3.在MTT法细胞增殖实验中,空白组、海藻酸钠/壳聚糖支架组和微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖支架组未表现出统计学差异(P>0.05)。4.在成骨活性相关检测中,与海藻酸钠/壳聚糖支架相比,微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖支架在磷酸盐缓冲液内的钙离子释放量无统计学差异(P>0.05);茜素红染色明显加深,细胞外钙盐沉积量明显增多;ALP染色更深;ALP活性表达,ALP、BMP2、OPN和Runx2成骨相关基因转录表达水平均得到明显提高(P<0.05)。5.在细胞黏附实验中,激光共聚焦显微镜下可见蓝色的圆形和类圆形细胞核三维立体分布于两种支架内,微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖支架内部附着的细胞数明显增多。实验结论:1.成功从大鼠体内提取出长梭形BMSCs,经成骨诱导和成脂诱导鉴定,其符合干细胞特征。2.成功制备出无菌载VEGF和万古霉素的微纳米羟基磷灰石/海藻酸钠/壳聚糖可塑性微球型支架材料。3.微纳米羟基磷灰石不干扰海藻酸钠/壳聚糖支架对细胞增殖活性的影响,但可明显提高其成骨活性以及对细胞的黏附性。