糖尿病是目前影响数亿人群的一类代谢性疾病。随着人类生活水平的不断提高,糖尿病在全世界的发病率逐年上升。常见的糖尿病可分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus,T1DM;Type 2 diabetes mellitus,T2DM）,其最终都是由于β细胞损失或功能异常导致。因此,揭示β细胞如何通过调控细胞内自身的分子机制响应外界因素（如葡萄糖、脂肪酸、免疫细胞因子等）的刺激成为糖尿病研究的新热门。由于遗传性的永久性新生儿发病型糖尿病（Permanent neonatal diabetes mellitus,PNDM）属于单基因型疾病,受外界因素影响较小,而且致病基因主要通过影响β细胞自身功能而导致糖尿病,因此PNDM模型逐渐成为科学家研究糖尿病中β细胞损失与功能异常（如胰岛素分泌受损）机制的有力工具。近年来,对于PNDM的深入研究极大地促进了科学家对T2DM和其他复杂型糖尿病发病机制的认识。目前,对人糖尿病研究和治疗具有重大推动作用的干细胞胰腺定向分化技术正在兴起,这项技术使得研究人员可以从病人或健康人多能性干细胞中获得大量分化的β细胞用于疾病研究,甚至进行β细胞移植治疗。由于此技术针对人的β细胞进行研究,因此在一定程度解决了动物模型与人生理功能先天性差异而导致的研究结果转化性差的难题。作为导致PNDM的致病基因,PERK是细胞内质网应激反应中重要的信号转导基因,突变后产生以严重的糖尿病、骨骺发育异常和智力发育迟缓为特征的Wolcott-Rallison综合征（WRS）,本研究将WRS病人体细胞重编程为诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）,测序发现该病人在PERK基因第9号外显子上存在GAAA四个碱基的缺失,随后利用CRISPR/Cas9技术将该病人特异性突变引入正常的人胚胎干细胞系Mell后,蛋白印迹实验发现该移码突变导致PERK蛋白翻译失败。接着将PERK野生型与突变型多能性干细胞定向分化为胰腺β细胞,发现PERK突变并不影响β细胞的发育形成,但是,与野生型β细胞相比,PERK突变细胞的胰岛素（Insulin,INS）总量下降、胰岛素前体蛋白（Pro-insulin,Pro-INS）与成熟胰岛素比例升高以及β细胞分泌能力下降,这在一定程度预示了PERK基因突变通过影响β细胞的胰岛素正常合成和分泌过程导致糖尿病。为了理解PERK突变对β细胞中的内质网应激反应和转录组的影响,对野生型和突变型β细胞进行了内质网应激反应检测和转录组测序分析。结果显示以剪切XBP1（XBP1s）为代表的一部分内质网应激基因表达急剧升高以及PERK靶基因EIF2α失去PERK的抑制而持续激活,与以上结果相一致,转录组测序结果发现帮助蛋白质翻译后进入内质网的辅助因子在PERK突变后显著上调并富集。这些发现为揭示内质网应激反应对β细胞损失和功能的影响研究奠定了基础和提供了重要线索。β细胞移植治疗糖尿病一直受到科学家的关注,直到近年来才逐步取得了一些重大进展。本研究通过结合人多能性干细胞胰腺定向分化技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术探索治疗单基因型糖尿病（尤其是PNDM）的可能性。首先通过获取PNDM病人的体细胞,重编程为诱导多能性干细胞,测序鉴定了该病人在INS基因起始密码子处存在单碱基突变,利用CRISPR/Cas9技术纠正该突变后,将突变和修复的干细胞定向分化为β细胞,发现突变的β细胞无法产生胰岛素蛋白和C肽（C-PEP）,但是修复的β细胞恢复了胰岛素蛋白的翻译,进一步通过糖尿病小鼠模型的体外分化β细胞移植实验证明,只有INS修复的β细胞能够拯救小鼠的糖尿病表型,表明了该基因修复和体外分化的β细胞移植方法有望治疗单基因型糖尿病。综上所述,本研究利用人诱导多能性干细胞技术、干细胞胰腺定向分化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了PERK基因突变导致的PNDM模型,初步解析了PERK突变对人β细胞功能的影响;同时,鉴定了一个新的PNDM糖尿病的胰岛素基因突变,并成功通过CRISPR/Cas9技术纠正该突变并修复突变的β细胞功能。为利用干细胞分化的β细胞移植方法治疗糖尿病奠定了基础以及提供了新的证据,展示了诱导多能性干细胞的胰腺定向分化技术在人类疾病模拟与细胞治疗领域的巨大应用价值。