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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是多种因素导致的慢性炎症性血管疾病,血管壁上泡沫细胞形成是AS斑块形成早期阶段,泡沫细胞分泌的炎症因子可以募集炎症细胞聚集,进一步诱导AS斑块的形成及加重AS炎症反应。ox-LDL过度被巨噬细胞表面受体摄取,是形成泡沫细胞主要原因之一。micro RNAs在心血管疾病有特异性表达谱,参与多种生理,病理反应。mi R-145是抗炎mi RNA之一,mi R-145可能调控下游靶基因白细胞分化抗原（CD40）等炎症靶基因延缓AS的发生发展,因此mi R-145作为CD40上游的调控因子,可能是治疗AS新的靶点。丹皮酚（Paeonol,Pae）是从中药植物牡丹的干燥根皮中提取纯化得到的主要活性之一,具有抗炎、降血脂、活血化瘀等作用,前期课题组已有研究证实Pae可以抑制AS的炎症反应,然而该抗炎的作用是否与Pae通过调控泡沫细胞mi R-145水平有关尚需进一步探究。首先在体内实验中,我们用高脂饲料复制Apo E-/-小鼠AS模型,观察Pae的治疗作用及对小鼠主动脉中巨噬细胞源性泡沫细胞中CD40蛋白及mi R-145表达的影响。在体外实验中,用ox-LDL作为诱导剂,使巨噬细胞诱导成泡沫细胞,观察泡沫细胞mi R-145及CD40蛋白表达情况以及丹皮酚的干预后的表达水平,从基因水平阐明Pae治疗AS提供新靶点和科学依据。基于以上研究背景,我们提出以下科学假说丹皮酚通过上调mi R-145,抑制CD40/NF-κB通路,减轻动脉粥样硬化小鼠血管巨噬细胞源性泡沫细胞炎症反应,发挥抗动脉粥样硬化的作用机制。目的探讨丹皮酚通过调控mi R-145,影响CD40/NF-κB通路,抑制动脉粥样硬化小鼠血管巨噬细胞源性泡沫细胞炎症反应,发挥抗动脉粥样硬化的作用机制。方法高脂饮食喂养Apo E-/-小鼠20周复制动脉粥样硬化模型,造模成功后,给予丹皮酚灌胃,分为正常对照组、模型组、丹皮酚中剂量组（200 mg/kg）、丹皮酚高剂量组（300 mg/kg）;油红O染色观察主动脉斑块病理形态;酶联免疫吸附法（ELISA）测小鼠血清白介素-1（Interleukin-1,IL-1）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）;激光共聚焦显微镜测主动脉蛋白CD40与CD36共定位;实时荧光定量PCR测主动脉mi R-145表达情况。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）刺激RAW264.7细胞建立巨噬细胞源性泡沫细胞炎症模型,将mi R-145模拟剂（mi R-145 mimic）、mi R-145抑制剂（mi R-145 inhibitor）转染入细胞,分为空白组、模型组、丹皮酚（60μmol/L,Pae）组、mi R-145 mimic组、mi R-145 inhibitor+Pae组、mi R-145inhibitor组、mi R-145 inhibitor+Pae组。油红O染色观察细胞荷脂情况,Western blot测蛋白CD40和核转录因子-κB（nuclear factorκB,NF-κB）磷酸化水平,ELISA测TNF-α、IL-1、IL-6。结果1.Pae降低Apo E-/-小鼠主动脉斑块面积的形成及主动脉泡沫细胞炎症因子的表达1.1 Pae降低Apo E-/-小鼠主动脉斑块面积的形成用高脂饮食喂养Apo E-/-复制AS模型,Pae可以减轻AS小鼠主动脉斑块面积的形成。1.2 Pae降低Apo E-/-小鼠主动脉泡沫细胞炎症因子的表达Pae降低Apo E-/-小鼠CD36蛋白与CD40蛋白共定位系数;降低Apo E-/-小鼠血清炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平;Pae可升高Apo E-/-小鼠主动脉mi R-145的含量。2.ox-LDL诱导巨噬细胞成泡沫细胞2.1 ox-LDL对巨噬细胞毒性的影响在ox-LDL浓度为80 mg/L时,与空白组相比有显著性差异（P＜0.05）,用此浓度刺激巨噬细胞,油红O染色显示巨噬细胞内有明显的脂滴,表面巨噬细胞源性泡沫细胞模型建立成功。2.2 ox-LDL对巨噬细胞炎症反应的影响ox-LDL浓度为80 mg/L时,巨噬细胞分泌的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α与空白组相比明显增多（P＜0.05）。2.3 ox-LDL对巨噬细胞表面CD36蛋白表达的影响ox-LDL浓度为80 mg/L时,CD36蛋白的荧光强度明显升高（P＜0.05）,巨噬细胞源性泡沫细胞模型建立成功。3.Pae上调巨噬细胞源性泡沫细胞中mi R-145的表达通过RT-PCR检测mi R-145水平,验证诱导后的巨噬细胞源性泡沫细胞的表达情况及丹皮酚对其的作用。结果表明:与空白组相比,模型组巨噬细胞源性泡沫细胞低表达mi R-145,丹皮酚作用下的细胞与模型组相比mi R-145水平有明显的上调,说明Pae可以升高ox-LDL诱导巨噬细胞成巨噬细胞源性泡沫细胞内mi R-145的表达。4.Pae对CD40/NF-κB通路的抑制作用由于巨噬细胞表面具有CD40受体,与配体结合后,激活NF-κB通路。实验通过Western blot法检测CD40/NF-κB通路上的蛋白表达。结果发现,模型组与空白组相比,CD40和NF-κB磷酸化蛋白水平升高,Pae作用后的巨噬细胞与模型组相比,CD40和NF-κB磷酸化蛋白水平降低,说明Pae对CD40/NF-κB通路有抑制作用。5.丹皮酚可能通过上调mi R-145的表达抑制CD40/NF-κB通路,降低巨噬细胞源性泡沫细胞的炎症反应。为了探讨Pae抑制巨噬细胞源性泡沫细胞炎症反应的作用靶点是否是mi R-145,向RAW264.7细胞转染了mi R-145 mimic、mi R-145 inhibitor,进而检测各组细胞mi R-145的表达情况及各组细胞上清液中IL-1、IL-6、TNF-α的表达。与空白组相比,mi R-145 mimic组mi R-145表达上调（P＜0.05）,mi R-145 inhibitor组mi R-145表达下调（P＜0.05）;Pae与Pae+刺激剂组相比,mi R-145表达上调（P＜0.05）,当Pae与刺激剂及mi R-145 mimic同时作用于细胞后,与Pae组+刺激剂组相比无显著差异,表明Pae促进mi R-145表达的作用被阻断,以上结果表明Pae对mi R-145有直接调节作用。ELISA法检测IL-1、IL-6、TNF-α的表达,实验结果表明,mi R-145 mimic组的细胞上清液中,三种炎症因子的分泌与模型组相比都有明显的降低,mi R-145inhibitor组与模型组相比则有明显升高;Pae联合mi R-145 mimic及刺激剂组的巨噬细胞与转染了mi R-145 mimic的巨噬细胞分泌的炎症因子明显降低,mi R-145mimic促进mi R-145 mimic的表达,同时促进丹皮酚对炎症反应的作用。以上结果表明:Pae对炎症反应的抑制作用很可能是通过调节mi R-145实现的。结论1.Pae可以抑制Apo E-/-小鼠主动脉斑块的形成及主动脉泡沫细胞的炎症反应。2.Pae可以抑制ox-LDL诱导巨噬细胞成泡沫细胞介导的炎症反应。3.Pae通过上调小鼠主动脉mi R-145水平,抑制CD40/NF-κB通路,从而减轻动脉粥样硬化小鼠血管泡沫细胞炎症,发挥抗动脉粥样硬化的作用。