山茱萸细胞悬浮培养及熊果酸含量分析

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山茱萸作为我国传统的名贵中药,具有有固虚脱、涩精气、补肝肾的功效。通过细胞培养的方式来充分有效地利用和开发山茱萸资源,以山茱萸不同部位为实验材料,利用植物组织和细胞培养技术,通过诱导山茱萸愈伤组织,建立山茱萸愈伤组织悬浮培养体系。对山茱萸以下几个方面进行研究,愈伤组织的诱导,愈伤组织疏松状态调控,以及悬浮培养体系细胞的生长特点和生长规律等。测量山茱萸中熊果酸的含量变化,为工厂化生产熊果酸提供实验数据及理论依据。在山茱萸愈伤组织诱导过程中,对外植体类型、灭菌条件、光照条件、激素种类和水平这几个方面,对山茱萸愈伤组织诱导率的影响、褐变情况以及生长状态的影响。结果表明:KT(3mg/L)+2,4-D(1mg/L)对嫩叶的诱导效果最好;在光照强度1500~2000lx,3%蔗糖,pH值为5.8左右时,山茱萸细胞生物量的增长率达到最大。山茱萸愈伤组织继代阶段,通过不同条件下的比较,获得愈伤组织结构疏松、生长良好的愈伤是细胞的悬浮培养的前提。结果表明在最佳继代培养配方:MS+KT(3mg/L)+2,4-D(1mg/L)上进行继代培养,最佳的pH为5.6~6.0,比较了光照条件对愈伤组织生长的影响,同时绘制了35天内山茱萸愈伤组织的生长曲线,这个培养阶段中的愈伤组织生长周期都呈现出“S”型,对数生长期的时间点是第10天,细胞生物量的达到最大值是在第28天。建立山茱萸细胞悬浮培养体系,对细胞悬浮培养体系的影响的因素很多,研究不同的接种量、蔗糖浓度、摇床转速、激素配方、培养过程中pH的变化。同时测定了悬浮培养中山茱萸细胞动态生长曲线和熊果酸的含量进行分析。本文得出山茱萸细胞悬浮培养的最佳条件如下:以MS基本培养基配制成液体培养基,调节蔗糖浓度为3%,调节pH为5.6,每瓶接种2g疏松的愈伤组织,最佳激素配方为:MS+4.0mg/LKT+2.0mg/L2,4-D。在以上条件下进行培养,细胞的生长在0~8d为生长迟滞期,在第8天后进人对数生长期,在第22d细胞生物量达到最大值,增长率达到200%以上。在悬浮培养过程中pH值变化趋势先降低,后升高。对山茱萸悬浮培养获得的细胞中熊果酸的含量进行测定,在26d时细胞中的熊果酸含量达到最大,为3.48mg/g,山茱萸果实成熟时,测量山茱萸果实中熊果酸的含量,平均值为2.70mg/g。悬浮培养的细胞组织中的熊果酸含量高山茱萸果实中熊果酸含量30%左右。
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