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[背景与目的]宣威地区非吸烟女性肺腺癌是严重危害人民健康的地方重大区域性疾病,其发生发展机制尚不明确。尽管大量的研究表明宣威肺癌的高发病率与室内燃煤使用密切相关,然而国家炉灶改进后,宣威肺癌的死亡率和发病率并没有明显下降。有研究发现,宣威女性肺腺癌有明显的家族聚集性,且其基因突变图谱与普通肺腺癌存在差异。为了研究宣威女性肺腺癌独特的遗传学基础,我们前期对宣威女性肺腺癌组织进行转录组测序及差异表达分析,发现胰十二指肠同源盒-1（PDX1）在宣威非吸烟女性肺腺癌中表达明显升高,且与患者的无疾病生存期（DFS）呈负相关,提示PDX1可能在宣威非吸烟女性肺腺癌中发挥促癌作用,是这一具有独特遗传学基础的宣威区域性高发肺癌潜在的特异性靶点。但目前PDX1在恶性肿瘤的作用机制不明确,尤其有关PDX1在肺癌中的研究更少。该研究旨在探索PDX1在宣威非吸烟女性肺腺癌组织及同一病人癌旁正常组织中的表达,并分析比较PDX1表达变化对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡能力及细胞生长周期的影响。[方 法]1、收集35对宣威非吸烟女性患者的肺腺癌组织标本和正常肺组织,采用免疫组织化学技术分析比较这两种组织中PDX1蛋白的表达水平。2、以Beas-2b细胞为对照,采用Western Blot技术比较PDX1在不同人肺腺癌细胞A549、XWLC-05、H838的表达水平。3、选择PDX1表达最高的细胞株采用CRISPR-Cas9技术敲除PDX1基因。设计4个sgRNA,构建PDX1-sgRNA载体,通过U6测序对比检测敲除质粒是否构建成功。对构建成功的敲除质粒经质粒提取后,采用三质粒包装系统（lentiCRISPR v2、psPAX2、PMD2G）通过239T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液后加入至肺腺癌细胞,嘌呤霉素（Puromycin）筛选,最后通过Western Blot实验验证敲除效率,从4个sgRNA所引导的CRISPR-Cas9敲除PDX1基因的肺腺癌细胞株中选择敲除效率最高的2个进行后续的表型研究。4、选择PDX1表达水平最低的肺腺癌细胞株用于PDX1过表达。将购买的PDX1过表达质粒psin-ef 1-puro-PDX1经过质粒转化、质粒提取、慢病毒包装后感染肺腺癌细胞,经Puromycin筛选Western Blot验证过表达,对过表达成功的细胞进行功能实验。5、通过CCK8实验观察PDX1敲除及过表达对肺腺癌细胞增殖能力的影响;利用Transwell实验和划痕实验评估PDX1基因水平变化对肺腺癌细胞侵袭/迁移能力的影响;采用流式细胞术（FCM）检测PDX1基因水平变化对肺腺癌细胞生长周期及凋亡能力的影响。[结 果]1、PDX1在宣威非吸烟女性肺腺癌组织和配对正常肺组织中的阳性表达率分别为:31.42%（11/35）、2.86%（1/35）,有统计学差异（P<0.05）。2、肺腺癌细胞株A549、XWLC-05、H838中PDX1蛋白的表达水平均高于Beas-2b,其中A549的表达最高,H838次之,XWLC-05最低,因此选择A549细胞株进行CRISPR-Cas9技术敲除PDX1基因,选择XWLC-05细胞用于过表达PDX1。3、4个PDX1-sgRNA敲除质粒均成功构建,慢病毒感染A549细胞后,与对照组 A549-NC 相比较,敲除组 A549-sg1、A549-sg2、A549-sg3、A549-sg4细胞中PDX1蛋白表达水平均明显降低,以A549-sg2、A549-sg4最低,将细胞A549-sg2、A549-sg4作为敲除细胞株用于后续细胞表型实验。4、相较XWLC-05-NC细胞,过表达组XWLC-05-PDX1细胞中PDX1蛋白水平显著升高。5、PDX1基因敲除组细胞A549-sg2和A549-sg4增殖速度较对照组明显减弱,差异有统计学意义（P<0.05）,细胞增殖能力下降;PDX1过表达细胞XWLC-05-PDX1的增殖能力较对照组XWLC-05-NC无明显变化（P>0.05）。PDX1基因敲除后,A549细胞穿过Transwell小室的细胞数减少,有统计学差异P<0.05),划痕时细胞的迁移速度明显减慢,差异有统计学意义（P<0.05）,细胞的侵袭迁移能力下降;PDX1基因过表达后,XWLC-05细胞穿至Transwell小室外侧的细胞数以及划痕时细胞的迁移速度均无明显改变（P>0.05）。敲除A549细胞中PDX1基因后,G1期细胞比例下降,S期细胞比例增加,差异有统计学意义（P<0.05）,结合CCK8增殖实验的结果,提示敲除PDX1基因可使A549细胞生长周期被阻滞于S期;同时PDX1基因敲除的A549细胞凋亡率明显上升（P<0.05）;过表达XWLC-05细胞中PDX1基因后,细胞各周期比例及凋亡率均无明显变化（P>0.05）。[结 论]1、PDX1在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中的表达较正常肺组织升高,不同肺腺癌细胞株A549、XWLC-05、H838中PDX1蛋白的表达水平不同,说明不同来源肺腺癌细胞PDX1表达水平不同。2、敲除PDX1基因可抑制肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,导致肺腺癌细胞S期阻滞,并促进其凋亡,过表达PDX1基因未能改变XWLC-05细胞的生物学行为,表明PDX1可能是肺腺癌治疗的潜在靶点。