论文部分内容阅读
目的:研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白能否通过激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制细胞凋亡和促进细胞增殖,提高Ct的感染率,为阐明pORF5质粒蛋白在Ct致病机制中的作用提供实验依据。方法:将本课题组前期已构建的pGEX-6p-1/pORF5重组质粒菌接种于LB固体培养基进行培养,进而扩大培养后经0.2 mM IPTG诱导后表达GST-pORF5融合蛋白,将融合蛋白经过树脂纯化后用蛋白酶切除标签GST,收集pORF5质粒蛋白并去内毒素。将0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL的pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞0 h、6 h、12 h、18 h、24 h后,收集细胞总蛋白和RNA,分别用Western blot技术和qRT-PCR技术检测HeLa细胞中β-catenin蛋白的表达水平;免疫荧光技术观察β-catenin蛋白的核转位现象。用10μM Wnt抑制剂IWP2预处理HeLa细胞1 h后,加入凋亡诱导剂TNF-α(25 ng/mL)处理4 h,利用Western blot技术检测β-catenin蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化;用Hoechst 33258荧光染色和流式细胞技术检测细胞凋亡情况。以最佳的pORF5质粒蛋白浓度刺激HeLa细胞8 h、12 h、24 h、36 h后,CCK-8法检测细胞增殖情况;qRT-PCR检测细胞黏附分子EpCAM和OLFM4的mRNA表达水平。10μM Wnt抑制剂IWP2预处理HeLa细胞1 h后,Ct血清型E型感染36 h,计算Ct子代包涵体数目的变化。结果:1.pGEX-6p-1/pORF5重组菌经IPTG诱导后表达分子量约54kDa的GST-pORF5融合蛋白;融合蛋白经蛋白酶酶切后,得到不含GST的pORF5质粒蛋白。2.β-catenin蛋白的表达量随pORF5质粒蛋白浓度和刺激时间的不同而变化,当15μg/mL pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18 h时,β-catenin蛋白的表达量达到峰值;免疫荧光观察发现:在pORF5蛋白刺激组中,β-catenin蛋白发生明显的核转位;Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWP2可降低β-catenin蛋白的表达并抑制β-catenin蛋白发生核转位。3.Western blot发现,与pORF5质粒蛋白刺激组比较,IWP2/pORF5组能上调Bax表达而下调Bcl-2表达;Hoechst染色结果发现,IWP2/pORF5组与DMSO/pORF5组相比,细胞凋亡率增加了20.3%(P<0.001),且抑制剂组细胞核碎裂和核固缩现象明显;流式细胞技术检测结果发现,与DMSO/pORF5组相比,IWP2/pORF5组细胞凋亡率升高了22.08%(P<0.001)。4.20μg/mL pORF5质粒蛋白浓度刺激HeLa细胞18 h时,Western blot检测Bcl-2和Bax的表达,发现Bcl-2表达上调、Bax表达下调;Hoechst染色结果发现,pORF5/TNF-α组凋亡率相比于TNF-α组凋亡率降低了27.9%(P<0.001),相比于正常组降低了5.4%(P<0.01);流式细胞技术检测结果发现,pORF5/TNF-α组相比于TNF-α组的细胞凋亡率降低了23.26%(P<0.001),相比于正常组的细胞凋亡率降低了2.97%(P<0.05)。5.各组在12-36 h的细胞增殖活性最大,pORF5质粒蛋白刺激组与IWP2/pORF5组相比,HeLa细胞增殖活性明显增加(P<0.05);与空白组相比,细胞增殖活性显著性增加(P<0.01);qRT-PCR检测细胞黏附分子的变化发现,pORF5质粒蛋白刺激组与IWP2/pORF5组相比,EpCAM、OLFM4和β-catenin的mRNA水平均增加(P<0.01)。6.免疫荧光观察包涵体,用公式计算得到Ct E的子代包涵体数目,其结果显示:正常组的IFU为2.79×10~7/mL,IWP2抑制剂组的IFU为1.16×10~7/mL,抑制剂组的IFU显著性降低(P<0.001)。结论:pORF5质粒蛋白通过激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制细胞凋亡和促进细胞增殖,提高Ct的感染率。