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小麦白粉病是小麦生产中的主要病害之一,严重危害小麦生产安全。发掘和研究抗小麦白粉病基因资源、培育和利用抗性品种是防治小麦白粉病最经济有效的途径。抗小麦白粉病基因Pm6来源于小麦近缘物种提莫菲维小麦,定位于2G染色体上。前人通过创制含有Pm6的普通小麦-提莫菲维小麦渐渗系,推进了该基因在小麦育种中的利用。研究发现,Pm6表现为生育期依赖的抗性,含有该基因的植株在4叶期之前感白粉病,四叶期及以后则高抗白粉病,在田间表现良好的成株期抗性。特别是Pm6与Pm2等其它抗病基因聚合后,高抗白粉病,在抗病育种中有重要的利用价值。Pm6的精细定位和克隆,不仅有助于解析其生育期依赖的抗性分子机制,也可以为其育种利用提供理论依据。在前期研究中,本实验室先后利用RAPD、RFLP、STS、SSR等多种分子标记初步定位了Pm6基因,明确了 7份含Pm6的普通小麦-提莫菲维小麦渐渗系中2G渐渗片段大小,发现渐渗系IGV1-465包含的渐渗片段最小,而IGV1-466中的渐渗片段最大。利用IGV1-465和IGV1-466分别与感白粉病小麦品种Prins构建分离群体,并利用比较基因组学方法开发标记,构建了Pm6区域的遗传图谱,将Pm6定位在2G长臂的标记CINA U127和CINA U123之间,克隆了该区域正向调控小麦白粉病抗性的LRR-RLK家族的两个成员。但进一步物理定位发现,它们均不在IGV1-465的渐渗片段内。推测由于提莫菲维小麦2G渐渗片段与小麦2B对应的部分同源区段之间存在重组抑制,导致定位存在偏差。本研究在以上研究的基础上,通过导入普通小麦品种中国春部分同源配对基因（Ph1b）的突变基因ph1b,克服2B/2G部分同源染色体间的重组抑制,创制和筛选目标区域发生交换的新的重组体,精细定位Pm6;预测和筛选Pm6的候选基因,并克隆候选基因进行功能验证。本研究的主要结果如下:1、小麦抗白粉病基因Pm6的精细定位及其候选基因预测（1）Pm6区域在已测序麦类基因组中的共线性分析在前人的研究中,IGV1-465中包含的2G染色体渐渗片段（2G465）被界定在标记CINAU134和CINA U140之间,对应2B染色体的物理区间跨度为57Mb。利用已公布的麦类作物（普通小麦、野生二粒小麦、乌拉尔图小麦、节节麦和大麦）的参考基因组信息,分析了这些物种中Pm6区域的共线性关系。利用中国春2B染色体基因组注释信息,在标记CINAU134和CINA U140之间提取了 689个高可信度基因,与其他麦类作物基因组比对,发现426个基因在8个基因组/亚基因组保守存在,且在不同基因组/亚基因组中的排列顺序基本一致,显示麦类作物中Pm6区域具有良好的共线性;同时也表明该区域在进化过程没有发生明显结构变异,基本可以排除2G/2B在定位区段的重组抑制是由染色体结构重排引起的可能性。利用流式细胞仪分拣了提莫菲维小麦2G染色体,经二代测序后拼接,获得2G染色体的草图序列,为精细定位Pm6和克隆抗病候选基因提供了重要的遗传信息。与中国春参考基因组2B序列比较,结合Pm6区间小麦55K芯片分析检测的SNP,共开发了 34个2G染色体特异的分子标记,比较这些标记在麦类作物基因组中的位置及排列顺序,发现2G染色体Pm6区域与其他麦类作物相应染色体区段也有良好的共线性关系。（2）克服2B/2G部分同源染色体间的重组抑制精细定位Pm6基因CSph1b是小麦品种中国春Ph1b基因缺失突变体,ph1b纯合时可促进部分同源染色体配对重组。前期研究发现,由于渐渗的2G区段与相应2B染色体区段存在重组抑制,难以进一步缩小Pm6定位的物理区间。本研究利用IGV1-465与CSph1b突变体杂交、回交,在BC1F1群体中挑选Pm6区域（2B/2G）杂合、ph1b纯合的单株（基因型为Pm6pm6ph1bph1b）,使其自交,在BC1F2后代中筛选获得2B和2G之间发生交换的重组体,同样也可以在BC1F2、BC1F2:3、BC1F2:4和BC1F2:5的剩余杂合体的后代中（等同于BC1F2）,筛选目标区域的交换单株。利用Pm6侧翼标记CIT02g-14-900bp和CIT02g-19-750bp,在820个BC1F2:3单株中筛选到164个重组体,结合重组单株对白粉菌生理小种E26的抗性反应型,将Pm6定位区间进一步缩小到标记CIT02g-13-500bp和CIT02g-18-300bp之间,对应物理区间大小为10 Mb。目标区段的重组率和每Mb的重组率分别为20%和0.54%。利用距离Pm6更近的侧翼标记CIT02g-13-500bp和CIT02g-18-300bp,在643个BC1F2:4单株中筛选到18个重组体,结合重组单株对E26的反应型,将Pm6定位区间进一步缩小到标记CIT02g-20-490bp和CIT02g-18-300p之间,对应物理区间大小为0.9 Mb。目标区段的重组率和每Mb的重组率分别为2.8%和0.28%。继续利用距离Pm6更近的侧翼标记CIT02g-20-490bp和CIT02g-18-300bp,在1190个BC1F2:5单株中筛选到1个重组体,结合重组单株对E26的抗性反应型,将Pm6定位区间进一步缩小到标记CInDel02g-3-130和CIT02g-18-300bp之间,对应物理区间大小为218 kb。目标区段的重组率和每Mb的重组率分别为0.084%和0.093%。本研究结果表明,利用小麦控制同源染色体配对体系,可以显著提高部分同源染色体2B和2G之间的重组率。通过三轮的交换单株筛选,将Pm6从最初定位的57 MB物理区间缩小至218 kb,为Pm6候选基因克隆奠定了基础。（3）Pm6候选基因的预测根据中国春参考基因组中2B染色体对应的Pm6定位区间序列的基因注释信息,发现该 218kb 区段包含TraesCS2B02G504600.2、TraesCS2B02G504700.1、TraesCS2B02G504800.1和 TraesCS2B02G504900.1 四个高可信度基因。将以上四个基因序列与提莫菲维小麦2G染色体survey序列比对发现,TraesCS2B02G504600.2、TraesCS2B02G504800.1和TraesCS2B02G504900.1可以比对到2G的同源序列,分别命名为 TiSNF2-G、TiUbox-G 和 TiNLR-G,TraesCS2B02G504700.1 找不到其对应的同源序列。对中国春转录组表达数据库分析发现,仅TraesCS2B02G504600.2和TraesCS2B02G504900.1受白粉菌诱导表达,其余两个基因不受白粉菌诱导表达。qRT-PCR分析发现,在携带Pm6的渐渗系IGV1-465中,二叶期叶片中TiSNF2-G和TiUbox-G均受白粉菌诱导上调表达并在24h达到峰值,而TiNLR-G表达受白粉菌诱导无显著变化;四叶期叶片中,TiSNF2-G和TiUbox-G均受白粉菌诱导上调表达并在8h达到峰值,TiNLR-G也受白粉菌诱导上调表达,并在24h达到峰值。TiNLR-G是一个编码包含CC、NBS和LRR结构域的NLR类型的抗病蛋白,由于在四叶期特异受白粉菌诱导表达,且目前已克隆的抗病基因大多都编码NLR类型蛋白,本研究选择TiNLR-G作为Pm6的候选基因进行后续研究。2、TiNLR-G基因的克隆与功能验证（1）TiNLR-G基因的克隆分别克隆了 IGV1-465中TiNLR-G基因的gDNA和cDNA序列,结果显示,该基因全长2,715bp,编码904个氨基酸,没有含内含子。结构分析发现,TiNLR-G编码典型的NLR类型蛋白,包含CC、NBS和LRR结构域。系统进化树分析表明,TiNLR-G与麦类作物B基因组中的同源基因亲缘关系最近,比较不同来源同源蛋白序列发现,除硬粒小麦2B染色体上的同源基因,TiNLR-G编码序列与其他物种中的同源蛋白相比,在LRR结构域存在2个氨基酸（535-536aa）的插入。（2）TiNLR-G在小麦抗白粉病中的功能分析利用单细胞瞬时表达技术在感病品种扬麦158中瞬间过量表达TiNLR-G,结果表明,过量表达目的基因的扬麦158叶片表皮细胞接种白粉菌后,吸器指数与对照相比显著下降（从56.77%下降到31.11%）。利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（VIGS）技术,在四叶期的IGV1-465中沉默TiNLR-G,结果表明,TiNLR-G的下调表达显著降低IGV1-465对白粉菌生理小种E26的抗性。由此推测,TiNLR-G正向调控小麦白粉病抗性。利用化学诱变剂EMS处理IGV1-465的干种子,在后代中鉴定出9个独立感白粉病突变体株系,克隆发现其中一个突变体的TiNLR-G基因的LRR结构域出现一个G＞A的SNP突变,该突变导致编码蛋白中丝氨酸到天冬酰胺的改变,蛋白三级结构预测发现,该突变引起了蛋白空间构象的改变。对其中三个感病突变体进行qRT-PCR分析发现,受白粉菌诱导后TiNLR-G均未上调表达,再次表明TiNLR-G在IGV1-465抗白粉病中发挥重要作用。分别构建了野生型TiNLR-G和突变基因TNLR-GMu的组成型过量表达载体,通过农杆菌介导法转化感白粉病小麦品种Fielder,获得野生型TiNLR-G转基因苗17株,qRT-PCR分析发现,转基因材料中TiNLR-G基因的表达量较受体Fielder提高了 50-375倍,但植株在苗期均表现出生长抑制并致死亡,没有获得转基因后代植株;获得突变基因TiNLR-GMu转基因苗4株,转基因材料中目的基因表达量较受体Fielder提高了 18-172倍,植株生长正常,但抗性鉴定发现TiNLR-GMu转基因株均感白粉病。推测TiNLR在抗白粉病中发挥作用,但其组成性的过量表达影响小麦生长发育。进一步克隆了长度为2.1kb的TiNLR-G启动子序列pTiNLR-G,共包含14个预测的顺式作用元件。利用单细胞瞬间表达的方法检测启动子活性,结果表明,pTiNLR-G受白粉菌诱导后具有启动活性。进一步构建pTiNLR-G驱动TiNLR-G的遗传转化载体,利用基因枪法转化感白粉病小麦品种扬麦158,获得512株再生植株,结合分子鉴定和田间成株期白粉病抗性,共获得4株阳性植株（T0-96,T0-176,To-181,T0-198）,其白粉病抗性反应型均为IT2,而受体扬麦158白粉病抗性反应型为IT6,表明在自身启动子驱动下,TiNLR-G转入小麦可以显著提高白粉病抗性。进一步证明TiNLR-G在小麦抗白粉病过程中发挥正向调控作用。初步研究了TiNLR-G特定时期受白粉菌诱导特异表达的表观调控机制。利用ChIP-QPCR检测目标基因的组蛋白甲基化水平发现,TiNLR-G在受白粉菌诱导表达时,基因的启动子区、5’UTR区以及编码区均出现不同程度H3K4me3组蛋白甲基化修饰,其中启动子区的H3K4me3富集程度最为显著,推测TiNLR-G基因时空表达调控与启动子区域的组蛋白甲基化修饰有关。