骨质疏松症（OP）是一种严重的健康问题,与绝经后中老年妇女尤其相关,其特点是骨骼脆性增加和微结构恶化,极易引发骨折。随着老龄化进程的加快,OP是一种日益重要的全球性公共卫生问题。骨重建是一种骨吸收和骨形成之间的连续过程,其中,骨吸收取决于破骨细胞（OCs）的活性,而骨形成取决于成骨细胞（OBs）的活性。绝经引起的雌激素缺乏导致OCs的形成和活性增强,OCs在骨丢失中起关键作用,OCs最终增加绝经期OP的风险。因此,抑制OCs的形成和功能,增强OBs的形成和功能是重要的治疗策略。目前,有各种药物可用于治疗绝经后OP,如雌激素替代疗法,双膦酸盐和降钙素等。但是,如果长期服用药物会带来较为严重的副作用,例如乳腺癌、子宫内膜癌和心血管疾病。因而,长期服用药物治疗OP的安全性引起了极大的担忧。在OP治疗中值得考虑的替代疗法是EMF,EMF治疗OP具有临床安全性、有效和非侵入性,在过去几十年中受到好评。据报道,临床上EMF可增加OP患者的骨密度（BMD）,在体动物实验中EMF可减少卵巢摘除（OVX）诱导的OP模型动物的骨丢失,离体细胞实验中EMF可影响体外细胞的增殖和分化。但是,EMF的功效目前还不确定,有关其发生机制的阐述众说纷纭。而且,还存在矛盾的研究结果。这些不同的结果通常归因于各研究小组搭建使用的EMF平台不尽相同,由EMF的不同强度,频率,波形和持续时间来解释。这导致人们对EMF治疗OP的科学性存有质疑。因此,能否抛开这些众多复杂的EMF参数找到一种方式来准确、简明、直观地描述EMF,从而提高实验的可重复性?有报道表明,EMF对OBs的主要影响与时域中EMF的参数无关,应鼓励分析扩展到EMF的频域特性。因此,重点研究EMF频谱可能有助于探明EMF对OP效应的可能机制。有很好的证据表明,当EMF的频率与关键离子的回旋频率相匹配时,会产生共振效应,该效应影响离子通过膜通道的速率进而产生其他系列生物效应。研究人员提出,其物理机制是离子回旋共振（ICR）。根据ICR理论,经本研究计算许多重要的生物相关离子(如Na⁺,K⁺和Ca²⁺)的共振频率是离散的频率点,在1-100Hz之间。除了共振频率的基频率之外,当EMF的频率等于回旋频率的高次谐波时,也可以产生共振效性。而且,经过计算这些高次谐波在100-3,000 Hz。另外,高频EMF对OBs和OCs有何效果鲜有报道。因此,我们设计了四种不同频段（1-100 Hz,100-3,000 Hz,3,000-50,000 Hz和1-50,000 Hz）的EMF,其中1-100 Hz和100-3,000Hz被指定为ICR频段;3,000-50,000 Hz被指定为高频段;1-50,000 Hz为同时包含ICR频段和高频段的混频段。本研究旨在探讨以下四个问题:（1）研制能产生不同频段EMF的发生装置;（2）不同频段EMF对小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化成熟的影响;（3）不同频段EMF对RANKL诱导小鼠RAW 264.7破骨前体细胞增殖和分化成熟的影响;（4）不同频段EMF对OVX小鼠OP的影响。第一部分不同频段EMF发生装置的研制目的:以ICR理论为基础,需研制一款能产生ICR频段、高频段以及同时包含ICR频段和高频段的混频段的EMF发生装置,进而利用该装置开展离体和在体实验研究。方法:利用National Instruments Labview 2012软件中的均匀白噪声信号发生器经滤波产生四种不同频段的EMF数字信号。将EMF数字信号经多功能数据采集卡转换为模拟信号。接着,功率放大器实现放大EMF模拟信号并驱动亥姆霍兹线圈产生最终所需要的不同频段EMF。结果:该装置可同时输出四种频段（1-100 Hz,100-3,000 Hz,3,000-50,000 Hz和1-50,000 Hz）的EMF,分别赋予别名:LP,1-100 Hz,低频;BP,100-3,000 Hz,中频;HP,3,000-50,000 Hz,高频;AP,1-50,000 Hz,混频。四种EMF信号的每个频谱分量具有相同的能量幅度（-40 dB）。其中1-100 Hz和100-3,000 Hz被指定为ICR频段,其可产生离子谐振效应。结论:该装置充分利用了计算机丰富的软硬资源,具有功能强、性价比高、可扩充性好、操作方便等优势。实验人员可通过图形用户界面操作虚拟仪器面板,极大的方便了实验研究的开展。第二部分不同频段EMF对小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化成熟的影响目的:本研究旨在探究四种不同频段EMF对MC3T3-E1成骨前体细胞分化为成骨细胞（OBs）的影响。方法:实验分为5组:Control（对照）,LP,BP,HP以及AP组。LP,BP,HP和AP组分别用四种频段EMF照射,每天3小时,持续6天。检测细胞增殖、分化以及成骨相关基因和蛋白表达。结果:LP,BP和AP促进MC3T3-E1细胞的增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性以及与成骨相关的mRNA和蛋白质表达。LP和BP对MC3T3-E1细胞的增殖和分化的促进作用无显著性差异,而AP对MC3T3-E1细胞的增殖和分化具有比LP和BP更强的促进效果。此外,与Control组相比,LP,BP和AP照射可升高MC3T3-E1细胞内RANKL/OPG mRNA和蛋白质表达的比值,本研究推测由LP,BP和AP引起的MC3T3-E1细胞分化为OBs能力的增强可间接引起破骨细胞（OCs）形成能力的增强。而HP抑制MC3T3-E1细胞的增殖、ALP活性以及与成骨相关的mRNA和蛋白质表达。结论:研究结果表明包含离子ICR频率的低频段LP和中频段BP不仅促进MC3T3-E1细胞分化为OBs,而且可间接促进破骨细胞的形成。不包含ICR频率的高频段HP可抑制MC3T3-E1细胞分化为OBs。同时包含ICR频段与高频段的混频段AP具有LP,BP和HP频段的叠加累积效应,其显著促进了MC3T3-E1细胞分化为OBs,并且间接促进了由OBs形成能力增强带来的破骨细胞的形成。第三部分不同频段EMF对RANKL诱导小鼠RAW 264.7破骨前体细胞增殖和分化的影响目的:本研究旨在探究四种不同频段EMF对核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的RAW 264.7破骨前体细胞分化为破骨细胞（OCs）的影响。方法:实验分为6组,包括Control,RL,RL+LP,RL+BP,RL+HP和RL+AP。将细胞接种到培养板,待贴壁后,除Control外,其他5组加入50 ng/mL的RANKL诱导RAW 264.7破骨前体细胞分化为OCs。然后,从加入诱导剂的样品中随机选择4组分别照射LP,BP,HP,AP四种不同频段EMF,每天照射3小时,持续6天。实验设计包括五个方面:增殖测定、凋亡测定、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、细胞骨架染色以及破骨相关蛋白质检测。加干预孵育6天后,由RAW 264.7破骨前体细胞分化的多核细胞被认为是OCs。结果:细胞增殖结果显示,照射2天后,各组之间细胞增殖没有差异。照射6天后,Control,RANKL,RANKL+LP以及RANKL+BP组细胞增殖无显著性差异,LP、BP对RANKL诱导的OCs增殖无影响。HP、AP显著抑制了RANKL诱导的OCs增殖（P<0.01）。四种频段的EMF照射3天对RANKL诱导的OCs的凋亡没有影响。细胞凋亡检测结果显示,照射6天,LP、BP对RANKL诱导的OCs凋亡没有影响。HP、AP显著促进了RANKL诱导的OCs的早期凋亡,对晚期凋亡没有影响。TRAP染色结果显示,RANKL能诱导单核RAW 264.7破骨前体细胞分化成为成熟的多核OCs,6天的LP、BP照射对OCs的形成能力没有影响,HP、AP抑制OCs的形成。细胞骨架染色结果显示,RANKL诱导形成的OCs骨架分布清晰规则,并在细胞周围形成许多丝状伪足,胞内F-actin荧光较强。LP、BP对OCs骨架没有影响。HP、AP使细胞骨架皱缩,F-actin荧光较若,有的出现胞核裂解。Western blot结果显示没有诱导剂的Control组RANK蛋白不表达。RANKL诱导组中RANK蛋白高表达。与RANKL诱导组相比,LP和BP照射均未改变RANK表达（P>0.05）,且LP与BP之间无差异。此外,与RANKL诱导组相比,HP和AP显著降低RANK表达（P<0.01）,而HP和AP之间没有差异。结论:RANKL能诱导单核RAW 264.7破骨前体细胞分化成为成熟的多核OCs,LP、BP对RANKL诱导的OCs的增殖无影响、对OCs的形成能力也没有影响,HP、AP抑制RANKL诱导的OCs增殖,并抑制OCs的形成。第四部分不同频段EMF对卵巢摘除小鼠骨质疏松的影响目的:本研究旨在探究四种不同频率的EMF对卵巢摘除（OVX）小鼠骨质疏松症（OP）的影响。方法:48只3月龄的雌性BALB/c小鼠按体重随机分为以下6组（n=8）:假手术对照组（Sham）,卵巢切除组（OVX）,OVX+LP照射组,OVX+BP照射组,OVX+HP照射组和OVX+AP照射组。OVX+LP,OVX+BP,OVX+HP和OVX+AP组分别照射于四种不同频段的EMF中,3 h/d,7 d/wk,持续8周。每周记录各组小鼠的体重,8周EMF干预结束时,麻醉后脱颈法处死小鼠。对血清进行生化分析,对右股骨进行生物力学检查,对左股骨分别进行μCT扫描分析和组织形态学分析,对右肱骨进行实时荧光定量PCR检测。结果:骨形成在OVX小鼠中轻微增强,微观上可通过与假手术组相比,稍微升高的血清骨形成标志物水平（BALP,OCN,OPG和P1NP）和成骨相关基因的表达水平（ALP,BMP-2,COL-1,OCN,OSX,Runx2,Wnt1,β-catenin,LPR5,OPG和RANKL）加以证实。此外,骨吸收在OVX小鼠中显著增强,骨吸收大于骨形成,微观上可通过与假手术组相比,显著升高的血清骨吸收标志物水平（TRAP-5b和CTX-I）和破骨相关基因表达水平（RANK和RANKL/OPG）加以证实。最终,OVX引起的加速的骨重建导致骨量减少,骨微结构和机械强度退化,宏观上可通过生物力学、μCT和骨的组织形态学特征加以证实。与OVX相比,LP和BP显著增加血清骨形成标志物和成骨相关基因表达。此外与OVX相比,LP和BP照射可使OVX小鼠骨内RANKL/OPG mRNA比值升高,本研究推测由LP和AP引起的OBs骨形成活性的增强可间接引起OCs骨吸收活性的增强。因而,LP,BP对OVX诱导的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微结构和机械强度的效果有限。与OVX相比,HP显著同时降低了血清骨形成和骨吸收标志物以及成骨和破骨细胞相关的基因表达。因而,HP对OVX诱导的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微结构和机械强度的效果仍然不佳。AP具有LP,BP和HP的累积效应,与OVX相比,其显著增加骨形成并降低骨吸收,最终可降低OVX诱导的OP小鼠的骨丢失。结论:OVX导致小鼠骨量减少和骨微结构和机械强度的退化,并且这种状况不被LP,BP和HP照射而改变。然而,AP通过促进骨形成和抑制骨吸收降低OVX引起的小鼠骨量的减少和骨微结构和机械强度的退化。骨质量反映了骨形成和骨吸收的平衡状态,其在细胞水平涉及OBs和OCs的协调性生长。ICR频段相关的EMF对OBs有积极影响,高频EMF对OBs和OCs有副作用。合理结合不同频段对成骨和破骨的作用,是治疗OP的关键。总结本文以“离子回旋共振假说”的探索和验证为主线,采用“工学-医学、微观-宏观、在体-离体”相结合的实验方案,开展了不同频段EMF对OVX小鼠OP的影响及其机理的体内外实验研究,研究结果发现:（1）ICR频段相关的EMF显著促进骨形成活性,并间接促进骨吸收活性。然而,OVX诱导的OP小鼠中骨吸收仍占主导地位,因而LP,BP对OVX诱导的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微结构和机械强度的效果有限。（2）高频段不仅急剧降低骨形成活性,而且显著降低骨吸收活性。因而,HP对OVX诱导的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微结构和机械强度的效果也不佳。（3）均包含ICR频段与高频段的AP既可显著促进骨形成活性又可显著降低骨吸收活性,最终可降低OVX诱导的OP小鼠的骨丢失。（4）ICR频段相关的EMF对OBs有积极影响,高频EMF对OBs和OCs有副作用。合理结合不同频段对成骨和破骨的作用,是治疗OP的关键。本研究主要研究创新点如下:（1）设计了可用于骨研究的基于白噪声频域特征的EMF方法,并筛选了EMF实验参数。（2）系统验证了不同频段EMF对成骨和破骨的效应,为揭示EMF对骨的非热生物效应作用机理提供了新的思路与实验依据。（3）动物实验表明本论文提出的EMF方法能够较好的改善去势小鼠的OP。