第一部分 肝细胞癌相关miRNA启动子甲基化位点的筛选验证与功能研究目的:在HCC的发生发展过程中,编码基因的启动子甲基化模式异常居功至伟。抑癌基因启动子甲基化是其在HCC中低表达的直接原因,与之相似,编码miRNA基因的启动子区域甲基化模式异常也同样与HCC的发生发展关系密切。因此,我们对miRNA启动子甲基化在HCC中的作用以及对HCC发生发展影响的分子机制展开研究。目的在于:通过生物信息学等方法筛选出与HCC总生存率、血管浸润、病理分级和临床分期相关的miRNA启动子甲基化位点并验证,然后进行功能分析,为以后的进一步研究提供依据。方法:1.从TCGA数据库中下载临床数据(Clinical)、miRNA表达谱数据(microRNA)、DNA甲基化数据(Methylation)和mRNA表达谱数据(mRNA),并进行整理,采用以下步骤筛选:①采用R语言中的“minfi”包分析这些miRNA启动子甲基化位点在HCC癌组织和癌旁组织中的Beta值差异,筛选出q值<0.05,在HCC与癌旁组织中Beta差值的绝对值大于0.1的miRNA启动子甲基化位点;②然后分析以上甲基化位点beta值与miRNA的表达相关性,筛选出beta值与miRNA表达呈显著负相关性的甲基化位点;③进一步从以上筛选出的甲基化位点中筛选出位于miRNA启动子区域2KB内(转录起始位点TSS上游2000bp内)的甲基化位点;2.由LASSO-COX算法构建HCC总体生存的miRNA启动子甲基化模型;LASSO-logistic构建HCC血管浸润、病理分级、临床分期的miRNA启动子甲基化模型,用于判断HCC患者总体生存、血管浸润、病理分级、临床分期,用ROC曲线分析及生存分析等方法评估所构建模型的准确性;3.以血管浸润特异性的miRNA启动子甲基化位点对应的miRNA为例进行功能分析;4.收集温州医科大学附属第一医院2017年6月-2018年4月期间进行手术切除的146例HCC患者的癌组织,根据病理结果分为血管浸润组和非血管浸润组,以血管浸润特异性的miRNA启动子甲基化位点为例,采用甲基化特异性的PCR方法检测前述甲基化位点的甲基化程度,并验证前述模型的准确性;5.将血管浸润特异性的mir-199a-3p mimic转染进入Huh7和HCC LM3两个HCC细胞系中,采用RTCA技术方法观察转染前后两个HCC细胞系的增殖能力的变化,采用Transwell小室迁移实验观察转染前后两个HCC细胞系的侵袭和迁移能力的变化。结果:1.筛选出的在HCC癌组织和癌旁组织中甲基化水平有差异的miRNA启动子甲基化位点共45个;2.构建的预测HCC患者总体生存的miRNA启动子甲基化模型共包含8个miRNA启动子甲基化位点,经校正曲线分析发现该模型判断HCC患者1年、3年、5年总体生存的c-index分别为0.605、0.608、0.611;tdROC曲线分析发现该模型判断HCC患者1年、3年、5年总体生存的AUC分别为0.624、0.647和0.638;生存曲线分析发现该模型能够很好地将HCC患者分为高危和低危组(P<0.0001),并且按HCC患者的临床特征进行分层后,该模型也能将大部分患者分为高危和低危组(P<0.05);经COX单因素和多因素回归分析发现该模型和肿瘤T分期是影响HCC患者总体生存的单独危险因素,联合二者判断总体生存具有更高的准确性;3.构建的辅助判断HCC血管浸润、病理分级、临床分期的miRNA启动子甲基化模型分别包含7个、10个、9个miRNA启动子甲基化位点,经ROC曲线分析发现前述三个模型判断相关指标的AUC分别为0.667、0.745和0.725;4.筛选出的血管浸润相关的7个miRNA启动子甲基化位点对应miRNA的靶基因参与了与恶性肿瘤(包括HCC在内)相关的多种生物学过程,比如:WNT信号通路,MAPK信号通路,mTOR信号通路等;5.经我院收集的HCC癌组织进行验证后发现血管浸润相关miRNA启动子甲基化模型的准确性与我们前期的生物信息学实验结论一致;将mir-199a-3p mimic转染进入Huh7和HCCLM3细胞后,Huh7细胞的增殖能力减弱,Huh7细胞和HCC LM3细胞的侵袭和迁移能力均减弱。结论:筛选出的miRNA启动子甲基化位点可用于预测HCC患者的总体生存率,可作为辅助判断HCC血管浸润、肿瘤病理分级、临床分期的生物标记物,并且为改善HCC的治疗和预后提供了新的靶点。第二部分 肝细胞癌相关lncRNA启动子甲基化位点的筛选验证与功能研究目的:lncRNA是除miRNA之外的另一类与肿瘤的发生发展具有密切联系的ncRNA,是近年来在肿瘤生物学领域出现的一颗冉冉升起的新星。在HCC的发生发展过程中,编码lncRNA基因的启动子区域甲基化模式异常也同样非常重要。因此,我们对lncRNA启动子甲基化在HCC中的作用以及对HCC发生发展影响的分子机制展开研究。目的在于:通过生物信息学等方法筛选出与HCC总生存率、血管浸润、病理分级和临床分期相关的lncRNA启动子甲基化位点并验证,然后进行功能分析,为以后的进一步研究提供依据。方法:1.从 TCGA 数据库中下载 Clinical、Transcriptome File、Methylation 和 mRNA,并进行整理,通过以下步骤筛选:①根据TCGA对HumanMethylation450芯片的甲基化位点注释,筛选出与lncRNA相关的甲基化位点(位于lncRNA启动子区域2KB内);②然后同样采用R语言中的“minfi”包分析这些lncRNA启动子甲基化位点在HCC癌组织和癌旁组织中的Beta值差异,筛选出q值<0.05,且在HCC癌组织与癌旁组织中Beta差值的绝对值大于0.1的lncRNA启动子甲基化位点;③分析以上甲基化位点beta值与lncRNA的表达相关性,筛选出beta值与lncRNA表达呈显著负相关的甲基化位点;2.由LASSO-COX算法构建预测HCC患者总体生存的lncRNA启动子甲基化模型;LASSO-logistic构建辅助判断HCC患者血管浸润、病理分级、临床分期的lncRNA启动子甲基化模型,用于判断HCC患者总体生存、血管浸润、病理分级、临床分期,用ROC曲线分析及生存分析等方法评估所构建模型的准确性;3.以血管浸润特异性的lncRNA启动子甲基化位点对应的lncRNA为例进行功能分析;4.收集温州医科大学附属第一医院2017年6月-2018年4月期间进行手术切除的146例HCC患者的癌组织,根据病理结果分为血管浸润组和非血管浸润组,以血管浸润特异性的lncRNA甲基化位点为例,采用甲基化特异性的PCR方法检测前述甲基化位点的甲基化程度,并验证前述模型的准确性;5.采用特异性抑制剂沉默Huh7和HCC LM3细胞内血管浸润特异性的PVT1,抑制PVT1的功能,然后采用RTCA技术方法观察沉默前后两个HCC细胞系的增殖能力的变化,采用Transwell小室迁移实验观察沉默前后两个HCC细胞系的侵袭和转移能力的变化。结果:1.筛选出的在HCC癌组织和癌旁组织中甲基化水平有差异的lncRNA启动子甲基化位点共1 13个;2.构建的预测HCC患者总体生存的lncRNA启动子甲基化模型共包含10个lncRNA启动子甲基化位点,经校正曲线分析发现该模型判断HCC患者1年、3年、5年的c-index分别为0.675、0.653、0.651;tdROC曲线分析发现该模型判断HCC患者1年、3年、5年的AUC分别为0.709、0.637和0.679;生存曲线分析发现该模型能够很好地将HCC患者分为高危和低危组(P<0.0001),并且按HCC患者的临床特征进行分层后,该模型也能将大部分患者分为高危和低危组(P<0.05);经COX单因素和多因素回归分析发现该模型和肿瘤T分期是影响HCC患者OS的单独危险因素,联合二者判断OS具有更高的准确性;3.LASSO-logistic方法构建的HCC血管浸润、病理分级、临床分期相关lncRNA启动子甲基化模型分别包含8个、22个、13个lncRNA启动子甲基化位点,经ROC曲线分析发现前述三个模型判断相关指标的AUC分别为0.657、0.797和0.724;4.筛选出的血管浸润相关的8个lncRNA启动子甲基化位点对应lncRNA的靶基因参与了与恶性肿瘤(包括HCC在内)相关的多种生物学过程,比如:PI3K-AKT信号通路等;5.经我院收集的HCC癌组织进行验证后发现血管浸润相关lncRNA启动子甲基化模型的准确性与我们前期的生物信息学实验结论一致;将si-PVT1转染进入Huh7和HCCLM3细胞后,两种细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力均减弱。结论:筛选出的lncRNA启动子甲基化位点可用于预测HCC患者的总体生存率,可作为辅助判断HCC血管浸润、肿瘤病理分级、临床分期的生物标记物,并且为改善HCC的治疗和预后提供了新的靶点。