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目的疼痛依病理学特征可以分为“伤害感受性疼痛”和“神经病理性疼痛”。其中“神经病理性疼痛”是由外周或中枢神经系统的疾病或损伤,及功能障碍所导致的疼痛。典型表现有:触诱发痛、痛觉过敏和自发痛,此时的疼痛信号与伤害性刺激的存在与否以及程度和性质不相干。神经病理性疼痛是困扰临床的顽疾也是基础研究的热点,以往的研究多围绕神经细胞展开,自20世纪90年代初期,神经胶质细胞的作用开始引起研究者的高度重视,并经大量研究证实,胶质细胞主要以炎症反应的方式参与了神经病理性疼痛的调解,抑制胶质细胞的激活能够减轻神经病理性疼痛动物的痛敏反应,在动物实验中使用胶质细胞调节剂比如:丙戊茶碱、己酮可可碱以及氟代柠檬酸等,均表现出了减轻痛敏反应的作用,但此类药物用于疼痛治疗目前还仅限于基础研究尚未用于临床。结合临床实际,目前在疼痛治疗领域广泛使用的糖皮质激素,在药理作用方面具有明确的抗炎和抑制免疫反应的作用,因此,在理论上我们推测糖皮质激素有可能通过抑制胶质细胞的活性,而发挥对神经病理性疼痛的治疗作用。这种推测需要大量的实验去进一步证实,而且其中的许多细节问题还有待于深入研究,比如激素的用药部位、剂量、剂型及用药时间等。尤其最近Mao等人报道了中枢糖皮质激素受体的激活将导致痛敏,同时糖皮质激素的不合理使用在临床还可能引发严重的不良反应,因此明确糖皮质激素及其受体在神经病理性疼痛中的作用机制,将有利于指导临床治疗。因此,本研究拟通过建立部分坐骨神经分支损伤致神经病理性疼痛大鼠模型,并以不同的方式给予糖皮质激素——得宝松以及糖皮质激素受体拮抗剂RU486(米菲司酮)作为干预因素,然后通过行为学、免疫组织化学、免疫印记法和ELISA等方法,观察神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学变化和脊髓胶质细胞活性、糖皮质激素受体的表达、NF-κB的表达及炎性细胞因子含量的变化,从而探讨在脊髓水平糖皮质激素及其受体对神经病性疼痛大鼠的影响。实验材料1、实验动物:雄性SD大鼠,体重250-350克。2、主要实验试剂:得宝松,RU486,兔抗胶质细胞酸性纤维蛋白(GFAP)抗体,兔抗糖皮质激素受体(GR)抗体,羊抗NF-κB P65抗体,TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒。3、主要实验仪器:Von Frey纤毛,BME-410C型全自动热痛刺激仪,电泳仪,半干转印仪,酶标仪,MetaMorph/Olympus C-5050/BX41图像分析系统,美国Alpha公司的Fluochem V2.0图像分析软件。实验方法1、鞘内置管术:按Yaksh的方法,从寰枕筋膜处置入椎管内导管8.5cm至腰膨大处,留置给药。2、SNI模型制作方法:按Decosterd和Woolf的方法,将大鼠左后肢坐骨神经的胫神经及腓总神经分支完全切断,而保留完整的腓肠神经。3、机械缩足反射阈值(MWT)的测定方法:用Von Frey纤毛,按Kingery的方法进行测量。4、热缩足反射持续时间(TWD)的测量方法:用BME-410C型全自动热痛刺激仪,按Hargreaves的方法进行测量。5、免疫组织化学法(LSAB法):用以检测脊髓胶质细胞酸性纤维蛋白(GFAP)和糖皮质激素受体(GR)的表达。6、免疫印记法:(Wstern blot法):用以测定脊髓内核转录因子-κB(NF-κB)P65和糖皮质激素受体(GR)的表达。7、酶联免疫吸附试验(ELISA法):用以检测脊髓中TNF-α和IL-1β的含量。8、实验动物分组:8.1行为学测试部分取48只大鼠随机分为6组,每组8只:1组:假手术组(Sh组)2组:部分坐骨神经分支损伤(SNI)模型组(S组)3组:模型+鞘内注射得宝松组(SD组)4组:模型+神经损伤局部注射得宝松(Sd组)5组:模型+鞘内注射RU486(SR组)6组:模型+鞘内注射RU486+神经损伤局部注射得宝松(SR-d组)每组分别在术前、术后1、3、7、14、21、28天测试行为学指标。8.2形态学测试部分取172只大鼠,随机分为8组,正常组4只,其余每组24只。1组:正常大鼠(N组)2组:假手术组(Sh组)3组:部分坐骨神经分支损伤(SNI)模型组(S组)4组:模型+鞘内注射盐水组(SN组)5组:模型+鞘内注射得宝松组(SD组)6组:模型+神经损伤局部注射得宝松(Sd组)7组:模型+鞘内注射RU486(SR组)8组:模型+鞘内注射RU486+神经损伤局部注射得宝松(SR-d组)除正常组外(仅有1个取材时点),其余各组内设6个取材时点分别为:术后1、3、7、14、21、28天9、统计学处理:数据均以均数±标准差表示,所得数据经SPSS11.5软件处理,组内比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),用Student-Neuman-Keuls检验进行两两比较,P＜0.05认为有统计学差异。结果(一)行为学指标的实验结果:1、部分坐骨神经分支损伤(SNI)的模型可在造模术后早期(24小时左右),患足即出现机械缩足反射阈值(MWT)的明显下降和热缩足反射维持时间(TWD)显著延长,与假手术组比较有统计学差异;在模型组鞘内注射得宝松和鞘内注射RU486,对大鼠患足的MWT和TWD值无显著影响。2、在模型组于神经损伤局部注射得宝松,能使大鼠患足MWT值下降幅度及TWD值的上升幅度减小,有统计学差异(提示对模型大鼠的痛敏有改善作用);而局部注射得宝松联合鞘内注射RU486,能使大鼠患足MWT值下降幅度及TWD值的上升幅度更小,其结果与单独局部注射的结果比较有显著性差异(提示对模型大鼠的痛敏有更明显的改善作用)。(二)大鼠脊髓GFAP的实验结果SNI模型使大鼠脊髓胶质细胞酸性纤维蛋白(GFAP)表达明显增加;在SNI大鼠的神经损伤局部或鞘内使用得宝松均能抑制GFAP的表达,且两组间比较无统计学差异;在SNI大鼠鞘内使用RU486或盐水对GFAP的表达无影响。(三)大鼠脊髓核转录因子(NF-κB)P65的实验结果SNI模型使大鼠脊髓NF-κB P65的表达量明显增加;在SNI大鼠神经损伤的局部或鞘内使用得宝松均能显著性地抑制大鼠脊髓NF-κB P65的表达;在SNI大鼠鞘内注射盐水或RU486对大鼠脊髓NF-κB P65的表达无显著性影响。(四)大鼠脊髓TNF-α和IL-1β的实验结果SNI模型使大鼠脊髓TNF-α和IL-1β含量明显增加;在SNI大鼠神经损伤的局部或鞘内使用得宝松均能显著性地减少大鼠脊髓TNF-α和IL-1β的含量;在SNI大鼠的鞘内注射盐水和RU486对大鼠脊髓TNF-α和IL-1β含量无明显影响。(五)大鼠脊髓GR实验结果:1、SNI模型使大鼠脊髓糖皮质激素受体(GR)表达增加;在SNI大鼠神经损伤局部使用得宝松对脊髓GR的表达无影响,而鞘内使用得宝松则使脊髓GR的表达明显增加;在SNI大鼠鞘内使用RU486和局部使用得宝松联合鞘内使用RU486均明显地抑制了脊髓GR的表达;在SNI大鼠鞘内注射盐水对GR的表达无影响。2、用免疫印记的方法检测大鼠脊髓GR蛋白表达量的变化趋势与免疫组化法检测的结果一致。结论1、糖皮质激素能明显抑制SNI大鼠脊髓胶质细胞的激活和NF-κB P65的表达,并减少TNF-α和IL-1β的产生。2、中枢(脊髓)糖皮质激素受体的激活,对SNI大鼠神经病理性疼痛的产生有协同作用。3、在外周神经损伤的局部使用糖皮质激素联合鞘内使用RU486,既发挥了激素的抗炎作用又抑制了脊髓糖皮质激素受体的过度激活,因此对SNI大鼠的痛觉异常有显著的改善作用。