背景和目的牙周炎是由牙周致病菌引起的牙周组织慢性感染性疾病,是口腔常见病、多发病,发病率高达80%以上。牙周炎会导致牙周组织结构破坏,牙周附着丧失,继而形成牙周袋甚至牙齿松动、脱落,是导致成年人失牙的主要原因[1]。临床上牙周炎的治疗方法包括牙周基础治疗,同时配合全身或局部应用抗生素治疗,以及手术、修复治疗和支持治疗[2]。成骨细胞导致的骨形成和破骨细胞引起的骨吸收之间维持着相互耦联的动态平衡,骨的形态因之能保持稳定。当各种骨吸收刺激因子诱导大量的破骨细胞活化,导致牙槽骨发生显著破坏吸收时,仅仅依靠简单的物理和化学治疗很难逆转牙槽骨出现的破坏趋势。因此,如果能够在牙周炎症的初期抑制破骨细胞分化成熟、减少牙槽骨的吸收,这对治疗牙周炎、维持患牙功能甚至保留患牙尤为重要。本课题以小鼠RAW264.7细胞为体外研究模型,研究CORM-3对RAW264.7这一小鼠源性破骨前体细胞向破骨细胞分化的抑制作用,并探讨其作用机制;并以C57小鼠为体内实验模型,检测CORM-3对实验性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,以期为牙周炎的临床治疗提供新的思路。RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞,该细胞株最初来源于Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤。通过RANKL诱导RAW264.7细胞获得成熟破骨细胞是一种较好的获取破骨细胞的方法。曾有多种破骨前体细胞系(如FDCP、HL-60细胞、C7细胞和FLG29.1等)用于破骨细胞的研究[5],但目前公认的唯一成系的破骨细胞前体细胞是RAW264.7[6],该细胞可表达破骨细胞表型标志基因,与破骨细胞的基因表达谱极其相似,且能形成骨吸收陷窝[7]。RANKL刺激RAW264.7细胞后,与骨吸收有关的基因如ca-thepsin K等表达显著上调,进一步表明RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型。在破骨细胞前体细胞至成熟破骨细胞的分化过程中有一系列标志性基因产生,可作为破骨细胞及其分化阶段的标识。RANKL/RANK/OPG是调节破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的关键系统[8],当多种刺激骨吸收因子作用于成骨/基质细胞后,成骨/基质细胞在其表面表达RANKL特异性的识别破骨细胞前体,并与其膜上的功能性受体RANK结合,刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞。同时RANKL还能通过RANK途径,使成熟的破骨细胞内迅速形成肌动蛋白环,激活成熟的破骨细胞发挥骨吸收功能。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是在破骨细胞中高度表达的关键酶,并参与破骨细胞介导的骨转换过程。组织蛋白酶K(Cathepsin K)是表达于破骨细胞上并以溶胶原形式存在的半胱氨酸蛋白酶。Cts-K与TRAP均为鉴定破骨细胞的重要基因[9]。基质金属蛋白酶(MMP)属于锌结合肽链内切酶家族。为包括骨组织在内的多种组织细胞外基质降解所必须。MMP,尤其是MMP-9在破骨细胞中高表达,是降解细胞外基质、参与骨重建的重要蛋白酶,在破骨细胞活性增强的骨吸收中起重要作用[10]。CORM是近年来新合成的一种CO复合物,经适当溶剂溶解后能够在生理环境下可控制地释放CO,可作为外源性CO供源。已有研究证实,CORM能抑制关节炎小鼠病变区内多种炎症分子的表达,有效改善其临床表征[11]CORM通过其抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用,可以减轻脂多糖诱导下的大鼠多器官功能损伤[12]。本课题组在前期研究中已发现CORM作为外源性CO供源,能够抑制炎症因子诱导的人牙龈成纤维细胞黏附分子的表达,降低免疫活性细胞的浸润和黏附[13];同时还发现CORM能有效抑制实验性牙周炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的升高,抑制牙槽骨的吸收及病变区域炎症细胞的浸润,证实CORM能有效抑制大鼠实验性牙周炎的病理进程。血红素氧合酶-1(HO-1)是血红素降解的限速酶。HO系统是广泛存在于人和哺乳动物体内的微粒体酶系统。在正常状态下,HO-1呈低水平表达,易受多种因素诱导表达,如血红素、细胞因子、CO[14]等。已有研究表明HO-1在骨改建过程中可起到直接的调节作用[15,16]。本课题通过培养小鼠RAW264.7细胞并对该细胞进行破骨分化诱导,建立体外破骨细胞分化体系,然后在该体系中加入CORM-3,证实CORM-3通过HO-1途径在一定程度上抑制破骨细胞的分化与成熟。同时通过建立实验性牙周炎小鼠模型,经腹腔注射CORM-3,发现CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的形成和牙槽骨的吸收。以往对牙周炎治疗的研究多数针对控制牙周炎症方面或聚焦研究成骨方面,本实验以抑制骨吸收为目标,从延缓牙周炎牙槽骨吸收进程入手,为牙周炎的临床治疗提供了新的思路以及实验基础和理论依据。方法1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为两组:对照组和破骨诱导组(100μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响RAW264.7细胞于0、100、200、400及800μM的CORM-3培养液分别培养24h和48h后,以CCK-8法检测不同浓度CORM-3对RAW264.7细胞活性的影响。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为三组:对照组、破骨诱导组(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3组(200 μM CORM-3+100μg/LRANKL+50μg/LM-CSF),每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表达将小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板,细胞分为四组:对照组、破骨诱导组(100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)、失活 CORM-3 组(200μM失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和 CORM-3 组(200 μM CORM-3+100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF),每组设 3 个复孔。细胞培养 5、7、9天后,用RT-PCR和Western Blot方法分别检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9和Cts-K四种破骨相关因子的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验将小鼠RAW264.7细胞以5×105细胞密度接种于12孔板,细胞分为五组:空白组、NC对照组、SH-1病毒组、SH-2病毒组和SH-3病毒组,每组均分为三个MOI值(MOI=40、50、60),感染5天后在荧光显微镜下观察选出最佳感染MOI值;用最佳MOI值组别的细胞进行PT-PCR和Westen Blot方法检测,筛选出感染效率最高的慢病毒进行后续正式感染实验。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表达的影响HO-1基因沉默后的小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板。细胞分为4组:对照组、破骨诱导组(100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF)、失活 CORM-3 组(200 μM 失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF)和CORM-3 组(200 μM CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF),每组设三个复孔。细胞培养5、7、9天后,分别用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收选择雄性8周龄C57小鼠36只(23g-25g)。将C57小鼠随机分为三组(每组12只),即正常组、慢性牙周炎组(CP组)及CORM-3干预牙周炎组(CORM-3组)。其中,CP组和CORM-3组采用丝线结扎上颌第二磨牙同时局部注射内毒素法建立牙周炎模型。CORM-3组和CP组自结扎当天起分别腹腔注射一氧化碳释放分子-3溶液(CORM-3,10 mg/kg/d)和等体积无菌生理盐水。分别于牙周结扎的第7天和第14天,各组分别处死6只小鼠,并制作双侧上颂骨标本。一侧上颌骨标本去除附着的牙周软组织用甲苯胺蓝染色后,在体视显微镜下观察每组牙槽骨吸收情况;另一侧上颌骨标本经固定、脱钙、透明、包埋后制作常规石蜡切片,TRAP染色后显微镜下观察每组牙槽骨内破骨细胞分化成熟的情况。结果1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立RAW264.7细胞加入破骨诱导液诱导5天后,TRAP染色显示有明显破骨细胞形成,且破骨细胞数量显著高于对照组(P<0.05)。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响24h和48hCCK-8检测结果均显示:1 00μM和200μM的CORM-3均不影响RAW264.7细胞的活性,且200μM的CORM-3对RAW264.7细胞增殖有显著的促进作用,而800μM的CORM-3显著抑制了RAW264.7细胞的增殖,(P<0.05)。因此选择浓度为200μM的CORM-3作为后续实验操作浓度。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化RAW264.7细胞破骨诱导的同时加入CORM-3,5天后TRAP染色显示CORM-3干预组仅有少量破骨细胞形成,且破骨细胞数量显著低于破骨诱导组(P<0.05)。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表达RAW264.7细胞进行破骨诱导后,用实时荧光定量PCR技术检测第5、7、9天4种破骨相关基因RANK,TRAP,MMP-9,Cathepsin K的mRNA表达,结果显示,第5、7、9天破骨诱导组中细胞四种因子mRNA的表达均显著高于对照组(P<0.05)。CORM-3组中四种因子mRNA的表达较之破骨诱导组有显著降低(P<0.05)。失活 CORM-3 组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA表达比CORM-3组有显著增强(P<0.05),但与破骨诱导组相比无显著差异(P＞0.05)。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组中细胞RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)。而CORM-3组中四种因子的蛋白表达较之破骨诱导组有显著降低(P<0.05)。失活CORM-3组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的蛋白表达显著高于 CORM-3 组(P<0.05),但与破骨诱导组相比无显著差异(P>0.05)。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验实验结果显示:SH-3病毒在MOI值为60时对小鼠RAW264.7细胞HO-1基因的沉默效率最高。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子(RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K)mRNA和蛋白表达的影响小鼠RAW264.7细胞中的HO-1基因沉默后,再进行破骨诱导,用荧光实时定量 PCR 技术检测第 5、7、9 天 RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA 表达。结果显示,破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组四种因子的mRNA表达均比对照组有显著增强(P<0.05)。三组间比较,四种因子的mRNA表达无显著性差别(P＞0.05)。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05),而CORM-3组与破骨诱导组相比,四种因子的表达无显著性差异(P<0.05)。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收实验性牙周炎小鼠经腹腔注射CORM-3 7天、14天后,小鼠上颌骨甲苯胺蓝染色结果显示,CP组牙槽骨高度显著低于CORM-3组(P<0.05)。上颌骨TRAP染色结果显示,CORM-3组牙槽骨内成熟破骨细胞数量较CP组显著减少(P<0.05)。结论1.CORM-3能够抑制RANKL+M-CSF诱导的小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化。2.CORM-3能够显著降低破骨相关因子RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。这一抑制作用是通过CORM-3释放的CO实现的。3.将RAW264.7细胞中HO-1基因沉默后,CORM-3对破骨诱导过程中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达的调控作用丧失,表明CORM-3对RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用是通过HO-1通路进行的。4.CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的分化成熟,抑制牙周炎小鼠牙槽骨的吸收。