尽管在过去的几十年中对癌症进行了大量研究,但仍然是近年来全球发病率和死亡率高的主要原因之一。致密的细胞外基质(ECM)严重阻碍了药物在实体瘤中的扩散,并导致肿瘤内氧密度降低,降低了化学疗法的效果。已经有研究表明,使用不同的蛋白水解酶(例如胶原酶(Col)或菠萝蛋白酶)可以直接附着到纳米颗粒的表面,降解ECM并改善其扩散,但是连接方法也可能由于构象变化或活性位点的阻断而损害酶的活性。因此,我们通过自由基聚合法合成胶原酶纳米胶囊(Col-nc),在Col表面形成工程聚合物涂层。它可以在到达作用位点之前保护酶的活性,同时能在肿瘤的微酸性环境下降解,释放的Col可以水解胶原蛋白。此外,选择H-重链铁蛋白(HFn)作为载体,可以有效地加载化疗药物阿霉素(DOX),并且具有自主靶向能力,可以使纳米颗粒更有效地内化到癌细胞中。然后,将Col-nc与HFn纳米笼组合,HFn中包裹了 DOX,Col-nc通过水解ECM中的胶原蛋白来增强纳米药物的肿瘤渗透性。体内和体外研究中,我们发现胶原蛋白可以被Col-nc/HFn(DOX)有效降解,增加了纳米颗粒在实体肿瘤部位的积累和渗透,并且可以缓解肿瘤内的缺氧,从而增强DOX的抗肿瘤作用。因此,该系统中增加纳米颗粒渗透和缓解肿瘤乏氧的策略有望为实体瘤的临床应用提供思路。首先,我们通过自由基聚合法合成Col-nc,丙烯酰胺和二甲基丙烯酸甘油酯分别用作结构单体和pH可降解的交联剂,2-氨基甲基丙烯酸乙酯盐酸盐提供用于下一步反应的氨基。测得的粒径大小在62 nm左右,并且在透射电镜下,Col-nc在水中分布均匀,没有明显的团聚,且表面光滑。在酸性条件下,聚合物涂层断裂,Col被释放出来水解ECM中的胶原蛋白来增强纳米药物在肿瘤部位的穿透。为了证明酸响应性,我们对Col-nc在pH 6.5的PBS溶液中处理不同的时间,然后,对处理不同时间后的Col-nc进行表征,激光纳米粒度分析仪测得的Col-nc的粒径大小逐渐从62 nm降到7 nm,最后的粒径大小与Col的相同,表明涂层断裂,Col被逐步释放出来。透射电镜结果与粒径大小变化一致,从透射电镜图中可看出涂层的降解和Col-nc表面的变化,表明Col-nc可以响应pH 6.5的肿瘤微环境。之后DOX@HFn上的羧基与Con-nc上的氨基反应将两者连接,形成最终的载体。我们通过傅里叶变换红外光谱和紫外全波长扫描图谱分别对载体的成功连接和DOX的包封进行了表征,测得包封率达到75.0%。最终制剂粒径大小在164 nm左右,从透射电子显微镜中可看出,HFn成功连接在Col-nc的表面。另外,我们采用茚三酮的方法,通过计算释放的游离氨基酸来测量Col、Col-nc和 C ol-nc/HFn(DOX)的酶活性。我们以4T1乳腺癌细胞作为细胞模型,通过摄取实验考察了制剂Col-nc/HFn(DOX)在细胞内的分布。从摄取结果中可以看出,最终制剂在细胞内的摄取明显高于游离的DOX,且大部分分布在细胞核的部位,主要是因为HFn具有靶向作用,可以使更多的制剂被摄取。然后,考察了 Col-nc和载体Col-nc/HFn对癌细胞及正常细胞存活率的影响。结果表明,载体对4T1和HUVEC细胞几乎没有抑制作用,说明载体具有较好的生物相容性。此外,我们通过MTT法考察了制剂对肿瘤细胞的杀伤作用。终制剂与细胞作用48 h后,细胞抑制率达89.5%,说明随着时间的延长,各制剂的抑制作用增加,且随着浓度增加,杀伤作用也在增强。最后,我们还对制剂Col-nc/HF n(DOX)在3D肿瘤球的渗透和对3D肿瘤球的抑制性以及体外的抗肿瘤活性进行了评估。结果表明,终制剂中Col-nc仍然具有酶活性且能增加制剂在3D肿瘤球的渗透。终制剂作用12 h后,几乎完全渗透到肿瘤球中。3D肿瘤球的抑制性实验结果显示,Col-nc能够增加制剂在3D肿瘤球的渗透,进而增强化疗药物的抗肿瘤疗效。最后,我们选择雌性BABL/c小鼠为实验动物,以4T1细胞株来构建乳腺癌动物模型。考察了 Col-nc/HF n(DOX)在荷瘤小鼠体内的成像及体内药效学。我们通过小鼠的活体成像实验研究了 Col-nc/HF n(DOX)在小鼠体内的分布,从活体成像图中可以看到,终制剂主要分布在肿瘤部位且积累的荧光强度比DOX@HFn的强。再次证明Col-nc/HFn(DOX)具有较好的渗透能力。通过小鼠给药前后的体重、肿瘤大小变化、HE切片和TUNEL实验来研究药物的体内药效学。从结果可以看出Col-nc/HF n(DOX)具有较好的抗肿瘤作用。另外,我们通过Masson’s染色分析和免疫荧光实验分别对制剂降解胶原蛋白、缓解肿瘤内部的低氧和肿瘤中的渗透能力进行了评价。结果与预期一致,Col-nc/HF n(DOX)可以有效的降解胶原蛋白,增加纳米粒在肿瘤中的分布,缓解肿瘤内部的缺氧,从而增加纳米粒的抗肿瘤作用。