论文部分内容阅读
目的:利用全基因组测序技术全面系统检测甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)核心基因组的可变基因、附属基因组的可移动元件及其编码的相关基因,系统阐明不同来源MRSA的遗传背景,并揭示特异性分子特征;探究MRSA基因突变与耐药表型的关系,阐明和揭示MRSA菌株的耐药机制;通过比较猪源与人源MRSA的耐药表型和分子特征差异,探索猪源与人源MRSA的特异性表型和分子标志物,利用特异性标志物建立判别模型并预测未知来源职业人群MRSA的来源类别,进一步明确LA-MRSA在猪与人群中的跨种属传播风险和传播途径,为有效控制LA-MRSA在人群中传播提供科学依据。方法:根据研究目的最终筛选出了63株人源MRSA,48株猪源MRSA和73株未知来源的职业人群MRSA。对所有MRSA菌株进行全基因组测序分析,运用网络数据库进行序列比对,获得MRSA菌株的MLST分型、spa分型、SCCmec分型、耐药基因、基因突变位点和毒力基因。两组率的差异比较采用Pearson x2检验或Fisher确切概率法。采用MEGA-X软件构建系统进化树和iTOL在线工具进行美化。研究基因突变位点与耐药表型的关系时,运用随机森林法筛选重要变量,然后采用x2检验进行关联性分析。MRSA跨种属传播风险预测中,运用参数方法(x2检验)和机器学习法(随机森林法)相结合筛选不同来源菌株(猪源与人源)的重要特征变量,并建立有先验概率、无先验概率的距离判别模型和logistic判别模型进行判别分析,然后利用最优模型预测未知来源职业人群MRSA的来源类别。结果:1、不同来源MRSA的分子特征:猪源MRSA主要克隆是ST9-t899-SCCmec XII型(15/48,31.3%),职业人群MRSA主要是ST9-t899-SCCmec XII型(23/73,31.5%),人源MRSA主要是ST188-t189-SCCmec V型(11/63,17.5%)。2、基因突变与耐药表型的关系:grlA基因突变(536Ser→Cys、410Tyr→Phe、80Ser→Phe、223Ile→Val)、grlB基因突变(139Asn→Ser)和gyrA基因突变(84Ser→Ala)与环丙沙星耐药存在正相关关系;ropB基因突变(481His→Asn)与利福平耐药存在正相关关系。3、猪源与人源MRSA的表型和分子特征的比较:猪源MRSA的耐药率明显高于人源MRSA(环丙沙星、庆大霉素、克林霉素、红霉素、四环素等)。猪源MRSA耐药基因中的tet(K)基因携带率高于人源MRSA,但aac(6’)-aph(2")、lnu(B)和tet(L)基因携带率低于人源MRSA。对于环丙沙星耐药菌株,猪源MRSA的grl A基因中有多个突变(V694M、S80F、S536C、Y410F和I223V),人源MRSA大多是一个突变(V694M);猪源MRSA的grlB基因中有两个突变(N139S和D530G),人源MRSA大多是一个突变(D530G);猪源MRSA的gyrA基因中有一个突变(S84A)。对于利福平耐药菌株,猪源与人源MRSA的rop B基因中H481N突变水平相当。对于头孢西丁耐药菌株,猪源与人源MRSA的pbp2基因中均存在一个突变(E315A);猪源MRSA的pbp4基因中存在一个突变(T189S),而人源MRSA大多有三个突变(T25A、T189S和E398A);猪源MRSA突变后对头孢西丁的抑菌圈值较人源MRSA突变普遍小。猪源MRSA毒力基因中的sea、seh、sep、splA、splB、splE、lukD和lukE基因携带率高于人源MRSA,但seg、sei、sem、sen、seo和seu基因携带率均低于人源MRSA。4、筛选特异性表型和分子标志物:参数方法和机器学习法相结合筛选出特异性表型和分子标志物,包括耐药表型(头孢西丁、克林霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平、氯霉素、复方新诺明、利奈唑胺)、耐药基因aac(6’)-aph(2")和毒力基因splE。5、建立判别函数进行判别预测:利用筛选出来的特异性表型和分子标志物,建立猪源与人源MRSA的判别模型并预测职业人群MRSA的来源类别,发现职业人群MRSA中53.4%预测为人源菌株、46.6%为预测猪源菌株。结论:1、职业人群与猪源MRSA的主要克隆均是ST9-t899-SCCmec XII型,提示可能存在MRSA在猪与职业人群之间跨种属传播的风险。2、grlA基因、grlB基因和gyrA基因突变与环丙沙星耐药存在正相关关系,提示grlA基因、grlB基因和gyrA基因突变可介导MRSA菌株对环丙沙星产生耐药性;ropB基因突变与利福平耐药存在正相关关系,提示ropB基因突变可介导MRSA菌株对利福平产生耐药性。3、猪源MRSA的特异性表型特征是对头孢西丁、克林霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平、氯霉素、复方新诺明、利奈唑胺耐药,特异性的分子特征是耐药基因aac(6’)-aph(2")和毒力基因splE。4、建立猪源与人源MRSA的判别模型并预测职业人群MRSA的来源类别,发现职业人群MRSA中53.4%预测为人源菌株,46.6%预测为猪源菌株。以上结果揭示,在动物职业人群中,LA-MRSA跨种属由动物传人的传播风险不容忽视。