目的:压力性损伤的高发率及难治性一直是困扰临床医务工作者的难题,严重者甚至危及生命[2]。被列为全球对患者造成严重伤害的五大最常见问题之一,给患者家属带来巨大的痛苦及经济负担。目前临床尚无治疗压力性损伤的理想用药。西医治疗普遍费用较高、难操作,传统中药组方龟板散由龟板配伍黄连、红粉和冰片组成,化腐解毒、活血止痛,用于诸疮溃烂,疮门不敛等症,效果良好,但外用散剂吸收慢,易诱发肉芽肿样病变,且中药普遍组方复杂,机理不明确。因此临床亟待开发一种成分简单、使用便捷、机理明确的外用中药新型制剂。喷膜剂为现代新型中药制剂,喷洒成膜,可以延长药物时间,隔离杀菌,符合压力性损伤的湿性愈合原理。本研究拟借鉴龟板散的组方,进行有效组分配伍、剂型改良及机理探讨。本研究在课题前期研究的基础上,结合组方的有效成分及药理作用选取龟板、黄连、冰片的有效成分单体S8、小檗碱（berberine,以下简称B）、右旋龙脑制成金创喷膜剂（S8+Ber,以下简称SB）,应用于早期大鼠压力性损伤模型,观察疗效。促进细胞增殖及抑制炎症反应是修复皮肤损伤的关键,已知毛囊干细胞（HFSCs）是皮肤修复中重要的干细胞来源,因此本研究拟从HFSCs信号通路及炎性介质角度探讨其作用机理,为中药在临床压力性损伤治疗的应用及新药开发打下基础。方法:取Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠,采用磁铁压迫法及缺血-再灌注来构建大鼠早期压力性损伤模型;造模后的SD大鼠于术后1d开始给予皮下注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U）,以50mg/kg剂量,连续注射7d。1.预实验确定金创喷膜剂（SB）各成分的最佳浓度,采用单因素设计及正交试验进行成膜材料筛选,优化处方工艺。2.采用PH值、成膜时间、溶膜试验、稳定性试验等对金创喷膜剂进行质量检测。3.实验分组及用药:将造模后的大鼠分为正常组、模型组、金创喷膜剂（SB）组、十四酸甾醇酯（S8）组、小檗碱（B）组、阳性对照组、溶媒组。正常组不做处理,模型组给予生理盐水,金创喷膜剂组给予金创喷膜剂,阳性对照组给予3M喷雾剂,溶媒组给予溶剂,每次1喷,每日两次（Bid）,早上8点,晚上8点,观察各组大鼠创面愈合情况,采用国际通用PUSH计分表,从创面大小、创面情况、总有效率、费用、愈合时间等方面对各组创面修复进行评分,病理切片观察皮肤创面修复情况,对各组用药疗效进行评价。4.采用Western-blot、实时定量聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术、免疫荧光检测各组大鼠皮肤创面组织修复过程中的Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白及m RNA表达情况;采用Brd U免疫荧光双标检测细胞增殖情况。5.采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）检测血清中CRP、IL-6、TNF-α的水平情况。6.取1～3 d SD乳鼠,按照课题组前期建立的方法分离培养鉴定HFSCs,采用2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐（CCK-8）筛选金创喷膜剂细胞用药浓度,采用免疫荧光、Western-blot、q RT-PCR技术检测细胞内Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、Lef1、C-myc、Cyclin D1基因的表达情况。成果:1.采用缺血10h再灌注2h外置磁铁压迫SD大鼠背部皮肤造模方法,成功构建了大鼠2期压力性损伤模型;2.筛选出金创喷膜剂各处方有效浓度为:S8 1.5mg/ml,B 2mg/ml,右旋龙脑1mg/ml,成膜材料最佳处方比例为PVP-K30含量为6%,HPMC含量为0.4%,乙醇浓度为30%。3.质量检测显示,制备的金创喷膜剂药液及药膜各方面性质良好,稳定性及适用性较强;成膜稳定性较好,储存时要避免高温。4.药效观察显示,用药组（SB、S8、B、阳性对照组）的PUSH计分普遍低于模型组,尤以SB、S8组修复效果明显,创面愈合总有效率高、愈合时间快（P<0.05）,相比对照组,SB、S8组的创面及周围皮肤毛发生长较快,皮肤结痂快而厚,且较早出现痂皮脱落;进一步HE染色显示,术后7d,SB、S8组创面皮肤毛囊生成增多,术后14d,SB、S8组可见新手的毛细血管;HE染色还显示,B组术后炎性因子浸润较轻。5.组织皮肤Western blot结果显示,同模型组比较,SB组术后3d,β-catenin、Left1、C-myc、Cyclin D1表达显著增加,GSK-3β表达下调（P<0.05）;术后7d,Wnt3a、β-catenin、Left1表达表达显著增加,GSK-3β表达下调（P<0.05）。S8组术后3d,Wnt3a、β-catenin、Left1表达显著增加;术后7d,Wnt3a、β-catenin、C-myc、Cyclin D1表达表达显著增加,GSK-3β表达下调（P<0.05）;术后14d,Left1表达显著增加,GSK-3β表达下调（P<0.05）;而B组各蛋白表达无明显趋势,P组各相关蛋白表达均呈现下降趋势。q RT-PCR检测结果亦提示,同模型组比较,SB组术后3d,Wnt3a、C-myc、m RNA表达增强,GSK-3β、Cyclin D1的m RNA表达下调（P<0.05）;术后7d,β-catenin、C-myc的m RNA表达增强,GSK-3β的m RNA表达下调（P<0.05）;术后14d,Cyclin D1的m RNA表达增强,GSK-3β的m RNA表达下调（P<0.05）。S8组术后3d,Wnt3a、β-catenin的m RNA表达增强,GSK-3β的m RNA表达下调（P<0.05）;术后7d,Wnt3a、β-catenin、C-myc、Cyclin D1的m RNA表达增强,GSK-3β、Left1的m RNA表达下调（P<0.05）;术后14d,β-catenin、Left1、C-myc的m RNA表达增强,GSK-3β的m RNA表达下调（P<0.05）。6.采用Brd U免疫双标结果显示,术后7d,相对于模型组,SB组、S8组Wnt3a蛋白表达均大幅增加,且主要集中在毛囊干区域。而B组增加不明显,Brd U标记显示SB和s8组新生的细胞明显增加,并且主要在毛囊区,其中S8细胞增值更明显,模型组的新生不明显。免疫荧光结果显示,相对于模型组,金创喷膜剂组、s8、小檗碱组均大幅增加,以S8组表达最强,且β-catenin蛋白在毛囊干位置表达较多。GSK-3β蛋白表达均降低,但各组间差异不大;Left1蛋白在正常组、金创喷膜剂组、S8组、小檗碱组在毛囊干表达均有增加,以SB组表达较强;金创喷膜剂组C-myc蛋白表达增强,其余各组表达不明显。Cyclin D1蛋白表达均有增加,以金创喷膜剂组、S8组增加明显,且S8组在毛囊干表达最强。7.ELISA检测,与模型组比较,SB组、B组TNF-α、IL-6、CRP水平降低（P<0.01）。8.免疫荧光显示,培养细胞表面表达CK15阳性。CCK-8检测显示,SB的最佳药物浓度为1ug/ml。Western blot结果显示,SB作用于HFSCs后β-catenin、Lef1、C-myc、Cyclin D1表达呈升高趋势,GSK-3β表达下降（P<0.05）。q RT-PCR检测结果提示,SB作用于HFSCs后β-catenin、Left1、C-myc、Cyclin D1的m RNA表达呈升高趋势,GSK-3β的m RNA表达下降（P<0.05）。结论:1.磁铁对称性压迫背部皮肤造模法构建SD大鼠早期压力性损伤模型稳定、简便、易于推广。2.本研究所制成的金创喷膜剂处方组成较合适,成膜较稳定,为开发临床压力性损伤用药奠定了实验基础。3.SB可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路及抑制炎症反应来促进大鼠早期压力性损伤的修复。4.SB可能激活HFSCs中的Wnt/β-catenin信号通路进而促进HFSCs的增殖。