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背景和目的:有研究指出非小细胞肺癌PD-L1的表达和肺癌驱动基因EGFR有关,并受EGFR调控。EML4-ALK作为EGFR之外的最重要的NSCLC致癌驱动基因,其和NSCLC中PD-L1的表达之间的相关性和分子作用机制尚不明确。本研究旨在探讨非小细胞肺癌PD-L1表达与EML4-ALK之间的相关性,明确PD-L1在NSCLC中的表达特点和临床意义,进一步研究EML4-ALK对PD-L1表达的调控作用和潜在机制。材料和方法:1.收集2011年2月-2014年12月在天津医科大学肿瘤医院接受根治性手术切除病理分期Ⅰ-Ⅲ期的EGFR野生型肺腺癌组织141例(所有组织均在天津医科大学肿瘤医院病理科接受ALK D5F3 Ventana IHC检测),采用免疫组化的方法检测癌组织PD-L1表达情况,分析其与ALK表达之间的关系,并进一步探讨PD-L1表达与肺腺癌患者的临床病理特征和预后的关系。2.应用Western Blot、RT-PCR、细胞免疫荧光检测正常人肺支气管上皮细胞系Beas-2B、人ALK阴性非小细胞肺癌细胞系A549、GLC-82,人ALK阳性肺腺癌细胞系H2228、H3122的PD-L1表达情况,选取细胞系Beas-2B、H3122进行后续实验。3.选择ALK抑制剂TAE684及3种不同的ALK siRNA处理H3122细胞系,同时设置阴性对照组;选择EML4-ALK(V1)重组质粒过表达Beas-2B细胞系中的ALK蛋白,同时设置阴性对照;应用Western Blot、RT-PCR检测转染及加药后PD-L1的表达情况,同时应用Western Blot检测JAK3、STAT3、AKT、ERK1/2等的表达情况,探讨EML4-ALK调控PD-L1表达的潜在分子机制。结果:1.应用免疫组化的方法检测141例肺腺癌组织中PD-L1的表达情况,PD-L1阳性率按照50%cut-off值,5%cut-off值,1%cut-off值分别为22.0%(31/141),42.6%(60/141),58.9%(83/141)。PD-L1阳性多见于肿瘤大于等于3.0cm(52.1%vs 32.4%,P=0.018,5%cut-off值;67.1%vs 50.0%,P=0.039,1%cut-off值)、病理类型为浸润性腺癌(45.3%vs 18.2%,P=0.038,5%cut-off值)及ALK重排(38.1%vs 15.2%,P=0.003,50%cut-off值;69.0%vs 31.3%,P<0.001,5%cut-off值;73.8%vs 52.5%,P=0.019,1%cut-off值)的患者。以50%cut-off值判定PD-L1阳性的标准进行Kaplan-Meier生存分析显示:PD-L1阳性患者的无病生存期(disease-free survival,DFS)和总生存期(overall survival,OS)明显短于PD-L1阴性患者(log-rank?~2=7.087,P=0.008,DFS;log-rank?~2=4.705,P=0.030,OS)。单因素分析显示:影响DFS的因素包括病理分期(HR,5.31;95%CI 2.81-10.03;P<0.001)、PD-L1过表达(HR,2.07;95%CI 1.16-3.70;P=0.014);影响OS的因素包括病理分期(HR,9.99;95%CI 3.36-29.70;P<0.001)、病理亚型(HR,3.76;95%CI 1.39-10.14;P=0.009)、辅助治疗(HR,0.18;95%CI 0.07-0.49;P<0.001)和PD-L1过表达(HR,2.63;95%CI 1.05-6.60;P=0.039)。Cox多因素分析显示:独立影响DFS的因素包括病理分期(HR,3.95;95%CI 2.26-6.93;P<0.001)、PD-L1过表达(HR,1.95;95%CI 1.14-3.33;P=0.015);独立影响OS的因素包括病理分期(HR,8.15;95%CI 3.01-22.07;P<0.001)、病理亚型(HR,3.75;95%CI 1.44-9.79;P=0.007)、辅助治疗(HR,0.23;95%CI 0.09-0.57;P=0.002)。PD-L1过表达是影响患者DFS的独立预后因素,PD-L1阳性患者DFS更短;PD-L1过表达是患者OS的预后不良因素,但PD-L1过表达并非非小细胞肺癌患者OS的独立预后因素。2.Western Blot结果显示:PD-L1蛋白在ALK阳性肺腺癌细胞系H2228、H3122中的表达要高于ALK阴性细胞系A549、GLC-82及正常肺支气管上皮细胞系Beas-2B;RT-PCR结果显示:PD-L1mRNA在ALK阳性细胞系的表达同样显著高于阴性及正常细胞系;细胞免疫荧光显示:PD-L1蛋白主要表达在细胞膜上,且H3122细胞PD-L1荧光强度显著高于A549细胞。3.Western Blot、RT-PCR结果显示:ALK抑制剂TAE684、ALK siRNA-1及ALK siRNA-2成功使H3122细胞中的ALK蛋白低表达,同时也下调了PD-L1蛋白的表达;转染了EML4-ALK(V1)重组质粒的Beas-2B细胞成功表达了ALK蛋白,同时也上调了PD-L1的表达;应用ALK抑制剂TAE684处理H3122细胞时,JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路蛋白的活性受到抑制;而当Beas-2B细胞过表达外源性EML4-ALK基因后,JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路蛋白表达升高,说明上述通路可能参与ALK对非小细胞肺癌PD-L1表达的调控。结论:PD-L1在ALK阳性非小细胞肺癌患者组织和ALK阳性非小细胞肺癌细胞系中高表达,同时PD-L1高表达可作为肺腺癌患者预后不良的标记物。抑制ALK蛋白表达可下调PD-L1的表达;过表达外源性EML4-ALK基因可上调PD-L1的表达。JAK-STAT3通路、PI3K-AKT通路及EKR1/2通路可能参与ALK对非小细胞肺癌PD-L1表达的调控。上述发现为肺癌的分子靶向治疗联合免疫治疗提供了理论依据。