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目的:1.观察神经干细胞中SUMO1的存在形式。2.观察地塞米松对神经干细胞增殖和分化的影响。3.观察地塞米松对神经干细胞的SUMO化修饰的调控。4.探讨地塞米松是否通过诱导小鼠神经干细胞的去SUMO化降低其干性潜能。研究内容及方法:1.神经干细胞中SUMO1的存在形式无菌条件下提取孕14.5天的C57BL/6胎鼠的纹状体,培养三代后,通过细胞免疫染色的方法对提取的细胞进行鉴定。作为阳性对照,神经干细胞经1%的FBS孵育48小时后,显微镜下观察细胞形态的变化;应用免疫荧光双染试验检测Nestin、β3-tubulin、GFAP、SUMO1和Oct4的表达情况;用Western Blot检测Oct4和SUMO1的表达水平。2.地塞米松对神经干细胞增殖和分化的影响神经干细胞经地塞米松刺激48小时后,显微镜下观察细胞形态的变化;应用CCK8、Edu和免疫荧光双染试验观察经地塞米松刺激后神经干细胞的增殖和分化情况。3.地塞米松对神经干细胞的SUMO化修饰的调控神经干细胞经地塞米松刺激48、96小时后,通过Western Blot检测神经干细胞中SUMO1、Oct4、Nestin、MAP2及某些SENP家族成员(SENP3、SENP5和SENP6)的蛋白表达情况。结果:1.SUMO1在未分化的神经干细胞中主要以共价态的形式存在免疫荧光结果显示原代培养的悬浮状态的细胞有Nestin、Sox2和Oct4的表达,证实为神经干细胞。与对照组相比,经1%的FBS孵育48小时后,神经干细胞由原来的悬浮状态变为贴壁状态,并且有分化为神经元的趋势。免疫荧光结果显示对照组有强烈的Nestin的表达,而β3-tubulin在悬浮的细胞球中表达较弱。相反地,实验组中β3-tubulin和GFAP有明显的表达,除此之外,地塞米松能使胞核中SUMO1和Oct4的表达减少,而胞浆中SUMO1的表达增多。Western Blot结果示,经1%的FBS孵育后,Oct4的表达水平下降,而与蛋白质结合形式的SUMO1表达水平下降,游离形式的SUMO1表达水平上升,差异有统计学意义。2.地塞米松能降低神经干细胞的增殖能力,促进分化经地塞米松刺激后神经干细胞不能维持悬浮的细胞球状态。CCK8和Edu示地塞米松能抑制神经干细胞的增殖。免疫荧光双染示经地塞米松刺激48和96小时后,细胞形态发生了明显的改变,在96小时后甚至出现了单个的神经元细胞,而且β3-tubulin阳性的细胞比在48小时时增多,这间接说明了地塞米松能促进神经干细胞的分化,并且可能存在时间依赖性。3.地塞米松能下调共价态的SUMO1,诱导神经干细胞的去SUMO化Western Blot结果示,经地塞米松刺激48、96小时后,神经干细胞中与蛋白质结合形式的SUMO1表达水平下降,相对应地,作为去SUMO化酶家族成员之一的SENP5的表达水平增加,而与SUMO1结合的蛋白的表达水平却降低,神经元的标志物MAP2的表达水平呈时间依赖性增加,差异有统计学意义。结论:地塞米松诱导小鼠神经干细胞去SUMO化并降低其干性潜能。