论文部分内容阅读
目的：研究胃癌细胞中ASPP2基因的mRNA表达与ASPP2基因启动子区域的甲基化的关系，观察甲基化抑制剂5-Aza-CdR对胃癌细胞的生长抑制作用，以及去甲基化处理后对胃癌细胞中ASPP2基因的mRNA表达和甲基化的影响，探讨胃癌发病的分子机制，并为胃癌甲基化抑制剂的临床治疗提供理论依据。方法：Real-time PCR检测两种胃癌细胞株（p53野生型MKN-45、p53突变型MGC-803）以及正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中ASPP2基因的mRNA表达；亚硫酸氢盐测序法（BSP）检测两种胃癌细胞株以及正常胃黏膜上皮细胞中ASPP2基因的启动子区域的甲基化状况；比较MKN-45、MGC-803、GES-1细胞ASPP2基因的mRNA表达以及甲基化的差异。CCK-8法检测经过不同浓度的5-Aza-CdR（甲基化抑制剂）处理胃癌细胞后的生长抑制率，以确定最佳的5-Aza-CdR浓度和作用时间；去甲基化处理后再次检测两种胃癌细胞中ASPP2基因的mRNA表达和甲基化状况；比较两种胃癌细胞株药物处理前后ASPP2基因的mRNA表达以及甲基化的变化。结果：1.p53野生型胃癌细胞MKN-45、p53突变型胃癌细胞MGC-803、正常胃粘膜上皮细胞GES-1中ASPP2基因mRNA的相对表达量分别为1.130±0.053、0.993±0.051和2.121±0.047。其中MKN-45细胞ASPP2mRNA的相对表达量较GES-1细胞显著降低（P<0.01），MGC-803细胞ASPP2mRNA的相对表达量较GES-1细胞显著降低（P<0.01），MKN-45细胞ASPP2mRNA的相对表达量较MGC-803细胞无显著差别（P>0.05）。2.MKN-45、MGC-803、GES-1细胞ASPP2基因启动子区域的甲基化率分别为（11.73±0.69）%、（2.39±0.25）%和（1.92±0.15）%。其中MKN-45细胞ASPP2的甲基化率较GES-1细胞显著升高（P<0.01），MGC-803细胞ASPP2的甲基化率较GES-1细胞无显著差别（P>0.05），MKN-45细胞ASPP2的甲基化率较MGC-803细胞显著升高（P<0.01）。3.当MKN-45细胞的5-Aza-CdR处理浓度为0.5和2.0μmol/L时，在同一浓度下的生长抑制率随着5-Aza-CdR作用时间的延长而降低（P均<0.05）；当5-Aza-CdR处理浓度为8.0μmol/L时，作用时间分别为24h、48h和72h的生长抑制率无显著差别（P均>0.05）；当5-Aza-CdR处理浓度为32.0和128.0μmol/L时，同一浓度下的48h作用时间的生长抑制率显著高于24h和72h（P均<0.05）。在同一作用时间下，各5-Aza-CdR浓度组的生长抑制率随着5-Aza-CdR浓度的增加而升高，呈药物浓度依赖性。当MGC-803细胞的5-Aza-CdR处理浓度为0.5μmol/L、2.0μmol/L、8.0μmol/L、32.0μmol/L时，同一浓度下的48h作用时间的生长抑制率显著高于24h和72h（P均<0.05）；当5-Aza-CdR处理浓度为128.0μmol/L时，细胞的生长抑制作用明显，且24h、48h和72h的生长抑制率无显著差别（P均>0.05）。在同一作用时间下，各5-Aza-CdR浓度组的生长抑制率随着5-Aza-CdR处理浓度的增加而增加，呈药物浓度依赖性。4.经24μmol/L5-Aza-CdR处理48h后，MKN-45、MGC-803细胞ASPP2基因mRNA的相对表达量分别为1.842±0.026、1.106±0.043，MKN-45细胞ASPP2mRNA的相对表达量较处理前显著升高（P<0.01），MGC-803细胞ASPP2mRNA的相对表达量较处理前无显著差别（P>0.05）。5.经24μmol/L5-Aza-CdR处理48h后，MKN-45、MGC-803细胞ASPP2基因启动子区域的甲基化率分别为（3.60±0.31）%、（2.23±0.11）%，MKN-45细胞ASPP2的甲基化率较处理前显著降低（P<0.01），MGC-803细胞ASPP2的甲基化率较处理前无显著差别（P>0.05）。结论：1.p53野生型胃癌细胞MKN-45的ASPP2基因启动子区域的异常高甲基化可能是ASPP2基因mRNA表达降低的分子机制。2.甲基化抑制剂5-Aza-CdR可以抑制胃癌细胞MKN-45（p53野生型）、MGC-803（p53突变型）的生长；并提升MKN-45细胞ASPP2基因mRNA的表达，ASPP2基因启动子区域的甲基化逆转是其可能的机制。3.ASPP2基因启动子区域的异常高甲基化导致的mRNA表达沉默可能与胃癌的发生相关。