【摘 要】
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微生物脂肪酶具有良好的底物选择性、不需辅因子、绿色环保等优点,已被广泛应用于食品、医药、洗涤剂等多种行业中。无论实际应用的工艺条件如何,热稳定性都是脂肪酶最受关注的特性之一。然而,当前的研究大多集中于中温脂肪酶,其耐热性能较差,难以满足大规模工业应用的要求。微生物嗜热脂肪酶却能很好地满足这一要求。本实验室前期已对一种来源于Thermomicrobium roseum DSM 5159的嗜热脂肪酶（
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微生物脂肪酶具有良好的底物选择性、不需辅因子、绿色环保等优点,已被广泛应用于食品、医药、洗涤剂等多种行业中。无论实际应用的工艺条件如何,热稳定性都是脂肪酶最受关注的特性之一。然而,当前的研究大多集中于中温脂肪酶,其耐热性能较差,难以满足大规模工业应用的要求。微生物嗜热脂肪酶却能很好地满足这一要求。本实验室前期已对一种来源于Thermomicrobium roseum DSM 5159的嗜热脂肪酶（Tr Lip）进行重组表达以及酶学性质的检测,发现其具有良好的热稳定性、p H稳定性及有机溶剂耐受性。然而,Tr Lip对中长链、长链底物的催化效率较低,大大地限制了其工业应用,因此本实验利用多种酶工程策略,对Tr Lip进行分子改造来提高其对中长链、长链底物的亲和性和催化效率,随后对最佳突变体进行杂化纳米花固定化来提高重复利用率,主要研究内容和研究结果如下:（1）脂肪酶Tr Lip的单点突变。分别从基于进化趋势的催化中心改造、基于口袋刚柔性的loop改造以及基于空间位阻的口袋大小改造这三个方面构建突变文库,进行Tr Lip的分子改造。所有突变体均在大肠杆菌表达体系中得到表达与纯化,并进行对中长链、长链底物的动力学参数的测定,以亲和性和催化效率为基础进行突变体的筛选。所有单突变体中,W219G具有最佳的改造效果,其针对p NP-C12、-C16、-C18的Km值均降低了近40%,催化效率分别比WT提高了4.09、2.81和2.93倍。除此以外,还有F265M等5种单突变体也在维持高稳定性的基础上提高了催化效率。（2）组合突变体的构建。以上述筛选出的多种单突变体为基础进行组合突变,最终筛选出催化效率进一步提升的三突变体W219G/F265M/R40A（V3）。对V3进行酶学性质的检测,发现与WT相比,其最适温度由85℃变为80℃,最适p H由8.5变为9.0。此外,V3仍保持了较高的热稳定性,其Tm值为96.41℃,且p H稳定性有所提升,能在更广的p H范围内（5.0-10.0）保持稳定。对V3进行动力学参数的测定,发现其针对这三种底物的催化效率均有所提升,分别升高至25488 L·mmol-1·min-1、8651 L·mmol-1·min-1、8746 L·mmol-1·min-1,是WT的5.80、3.99、4.77倍。对V3进行机制解析,发现空间位阻的减小是催化效率提升的主要原因,而疏水力、氢键、Pi-Pi相互作用等则会导致热稳定性的变化。（3）突变体的杂化纳米花固定化。对V3进行杂化纳米花固定化,并以包封率和酶活回收率两个重要参数为基础优化固定化酶的制备条件。最终筛选出Cu2+和Ni2+两种金属离子,分别在酶浓度为0.05 mg·m L-1、0.02 mg·m L-1,金属离子浓度均为3 mmol·L-1时达到最佳固定化效果。利用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱及X射线衍射对固定化酶的表面特征进行研究。通过酶学性质研究发现,两种固定化酶Cu-V3和Ni-V3较游离酶具有更优异的储藏稳定性。此外,Ni-V3具有良好的重复利用性,其在重复利用5次以后,仍具有约60%的初始酶活力。
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