植物源烟水调控丹参毛状根中丹参酮类成分的积累及机制研究

来源 :济南大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:shicyh
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丹参源于唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎,始载于《神农本草经》,具有活血化瘀、调经止痛之功效,是我国常用名贵大宗中药材之一。丹参主要活性成分分为两类:水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类,其中丹参酮类包括二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA等。野生丹参数量连年减少,栽培品种出现严重退化现象,导致丹参药材质量下降。如何利用新的技术和手段提高丹参活性成分已成为重要内容。植物源烟水(Plant-derived smoke water,SW)是指植物焖烧产烟入水所得的水溶液,KAR1被认为是烟水中的主要活性成分。研究表明烟水在促进种子萌发、提高幼苗成活率、农作物增产等方面均有显著效应,而在中药材方面研究较少。课题组前期发现烟水能有效促进丹参次生代谢产物的积累,但其作用机制尚不明确。本论文以丹参毛状根为材料,利用高效液相色谱技术和代谢组学手段研究SW和KAR1对丹参酮等次生代谢产物积累的影响;利用信号分子供体、淬灭剂和抑制剂研究介导KAR1调控丹参酮类成分积累的信号分子;利用转录组学技术研究SW和KAR1对丹参酮类成分积累的信号转导及分子机制,以期为揭示烟水影响丹参次生代谢提供数据支持。主要研究结果如下:(1)SW及KAR1对毛状根中丹参酮的含量具有促进作用。SW(1:500,V/V)处理后毛状根中丹参酮I含量在第1、3、5、9 d分别是对照组的1.4、2.6、1.2、1.2倍,SW(1:1000,V/V)处理后毛根中丹参酮I含量在第1、3、5、9 d分别是对照组的2.9、3.1、1.3、1.2倍,相较于对照组KAR1处理后第1、3 d毛状根中T-I含量显著性增加;不同浓度SW和KAR1处理后丹参酮IIA的含量略有增加,其中SW(1:1000,V/V)处理1 d后显著提高了丹参酮IIA含量(P<0.05)达到143.36 mg/g,KAR1处理1 d后显著提高了丹参酮IIA含量(P<0.05)达到117.89 mg/g;SW对隐丹参酮含量的影响呈浓度依赖性增加,KAR1处理第5 d隐丹参酮含量显著增加;与对照组相比,SW和KAR1处理后第1、3 d,毛状根中二氢丹参酮含量显著增加(P<0.05)。结果表明SW和KAR1对毛状根丹参酮物质的积累具有重要影响,其中对丹参酮I的促进作用尤为显著。(2)非靶向代谢组学结果显示SW和KAR1处理后毛状根代谢水平发生显著变化。与对照组相比SW处理导致93个代谢物上调,正离子模式下有43个上调,负离子模式下上调的有50个;共有85个代谢物下调,正离子模式下有60个下调,负离子模式下上调的有25个。KAR1处理组与对照组比较共有112个代谢物上调,正离子模式下有59个上调,负离子模式下上调的有52个;共有86个代谢物下调,正离子模式下有54个下调,负离子模式下上调的有32个。对这些代谢物的进一步分析,发现多涉及到次级代谢物合成代谢、氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢等一系列代谢途径。结果表明,SW和KAR1对丹参毛状根代谢产物的影响较大。(3)KAR1诱导毛状根中丹参酮I的合成依赖于内源性信号分子NO和JA的积累。KAR1处理后丹参中NO和JA含量有显著性变化(P<0.05),KAR1处理24 h、48 h后毛状根中NO含量与对照组相比分别增加了48.69%、21.03%,KAR1处理后毛状根中JA水平呈时间依赖性增加,12 h后KAR1处理组JA含量为对照组水平的1.41倍(P<0.05);PBITU和cPITO(NO特异性清除剂)显著抑制了KAR1诱导的JA含量的积累(P<0.05),SHAM和PrGall(JA合成抑制剂)对NO的含量没有显著影响(P>0.05);SHAM和PrGall显著抑制了SNP(NO供体)对丹参酮I的促进作用(P<0.05),JAMe对毛状根中丹参酮I的促进作用并未被PBITU或cPITO抑制(P>0.05)。结果表明KAR1促进丹参毛状根中丹参酮I的合成依赖于NO和JA的积累,并且NO是通过JA信号途径来调节KAR1诱导T-I合成。(4)转录组学分析结果显示SW和KAR1处理后毛状根转录水平发生显著变化。测序共获得654959272个raw reads,过滤后得到643853930个clean reads,获得158555个Transcript、138993个Unigene,毛状根主要的生命活动过程几乎都被覆盖了。对这些Unigene进行深度分析,发现SW和KAR1处理使毛状根产生了多种强烈反应,注释到糖酵解代谢过程基因、糖基转移酶基因、萜类次生代谢过程基因等表达水平发生变化,导致毛状根的整体代谢轮廓发生变化。通过qRT-PCR进行验证,SW和KAR1处理后丹参酮合成途径中6个相关酶基因AACT、HMGS、HMGR、DXS、DXR、CMK的表达情况,基本与转录组数据一致。结果表明SW和KAR1处理后毛状根在转录水平的变化较大。
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