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背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重危害女性健康。发病率占全身各种恶性肿瘤的7%~10%,死亡率约占确诊率的34.17%。早期诊断和有效治疗可降低乳腺癌的死亡率。药物化疗在乳腺癌的治疗中起着重要作用。然而肿瘤细胞耐药性的产生常常导致肿瘤化疗失败。肿瘤细胞对化疗药物的耐药可分为内在性和获得性两类。内在性耐药是指肿瘤细胞固有的对抗癌药物不敏感,而获得性耐药是指肿瘤细胞在药物治疗初始时对化疗药物敏感,但经过几个周期的药物治疗后,逐渐产生药物疗效下降,对药物越来越耐受。根据耐药表型的不同,细胞耐药可分为原药耐药(primary drug resistance,PDR)和多药耐药(multidrug resistance,MDR)。PDR是指仅对诱导药物产生耐药。而MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药的同时,对其他结构不同和作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因,也是肿瘤化疗亟待解决的问题。目前,MDR的机制主要分为外排(Pump)和非外排(Non-pump)耐药两个方面。药物外排的产生主要是因为ABC转运蛋白家族成员蛋白表达异常,利用ATP水解产生的能量,把药物从细胞内泵到细胞外,导致细胞内的药物浓度降低,从而使肿瘤细胞对化疗药物不敏感。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是最常见的ABC转运蛋白,其他常见的ABC转运蛋白有多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein,MRP)和乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)等。非外排产生的主要原因为凋亡抵抗(Anti-apoptotic defense)。细胞可以通过多种途径激活抗凋亡程序,提高肿瘤细胞的存活,延迟凋亡,获得凋亡抵抗,导致肿瘤细胞形成多药耐药。肿瘤细胞耐药逆转剂的临床应用一直未取得显著性的进展,主要是因为这些逆转剂主要针对肿瘤耐药因素中的单个因素治疗,尽管能有效的抑制某个特定耐药的机制,但不能作用于其他耐药机制,因而不能完全逆转肿瘤的耐药。因此,发现新的多药耐药相关蛋白,对进一步认识肿瘤耐药发生的机制,以及为研究多药耐药提供新的治疗靶点,具有重要意义。膜联蛋白(annexin)是一类钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族,参与动植物的各种组织细胞膜的转运、囊泡的运输、信号转导等多种生物学活动。近年来研究发现膜联蛋白不仅在肿瘤的发生发展起着重要作用,而且与肿瘤的多药耐药的产生密切相关,如膜联蛋白a1在卵巢癌耐阿霉素中表达升高,下调人卵巢癌中膜联蛋白a1的表达,其对阿霉素等化疗药物的敏感性上升。膜联蛋白a2、a3、a4、a11等在肿瘤细胞耐药株中表达异常,上调或者下调其表达,均能在某种程度上逆转耐药。膜联蛋白a5(annexina5)是膜联蛋白家族中含量最多,分布最广的蛋白之一,其在人鼻咽癌耐顺铂细胞株(cne2/cddp)、人胃癌耐顺铂细胞株(sgc-7901/ddp)及乳腺癌耐阿霉素株(mcf-7/adr)中表达升高,而在乳腺癌耐美法仑(melr/mcf-7)、米托蒽醌(mcf-7/mx)、依托泊甙(mcf-7/vp)的细胞株中表达并未升高。乳腺癌耐阿霉素细胞株mcf-7/adr是以阿霉素低浓度加量持续诱导,不仅具有耐阿霉素的特性,经检测mcf-7/adr细胞株同时对顺铂、多西他赛也耐药。因此是检测多药耐药的理想模型。目的:1.比较乳腺癌阿霉素耐药株mcf-7/adr和乳腺癌敏感株mcf-7中膜联蛋白a5的表达;应用短发夹rna(shorthairpinrna,shrna)干扰方法敲低mcf-7/adr细胞株中膜联蛋白a5的表达,体外药敏实验检测其对阿霉素耐药性能否逆转。2.检测在下调膜联蛋白a5基因表达后mcf-7/adr细胞株的abc转运蛋白p-gp的mrna和蛋白水平及其活性的改变,分析阿霉素作用于膜联蛋白a5基因表达下调的mcf-7/adr细胞后凋亡相关蛋白parp的改变,以探讨下调膜联蛋白a5基因表达逆转耐药的分子机制,为临床治疗乳腺癌的多药耐药提供新的分子靶点。方法:1.利用western-blot和荧光定量pcr技术比较乳腺癌阿霉素耐药株mcf-7/adr和乳腺癌敏感株mcf-7中膜联蛋白a5的表达。2.针对膜联蛋白a5mrna序列,设计、合成三条shrna序列:5-ccgggctggaattgatgaagctcaactcgagttgagcttcatcaattcc-agcttttt-3(annexina5-1),5-ccggccatgattaagggagatacatctcgagatgtatctcccttaatcatg-gttttt-3(annexina5-2),5-ccggcgcgagacttctggcaatttactcgagtaaattgccagaagtctc-gcgttttt-3(annexina5-3)。并构建到载体plko.1上。慢病毒法转染mcf-7/adr细胞后,嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞,并利用western-blot和荧光定量pcr技术验证敲低效果。选出下调效率最好的一组细胞进行后续实验。3.以mtt法分析膜联蛋白a5下调后耐药株阿霉素敏感性的改变。应用流式细胞仪、荧光定量pcr和荧光共聚焦技术分析在下调膜联蛋白a5基因表达后mcf-7/adr细胞的abc转运蛋白p-gp的mrna和蛋白水平及其活性的改变。4.以western-blot方法分析阿霉素作用于膜联蛋白a5基因表达下调的mcf-7/adr细胞后凋亡相关蛋白parp的改变。结果:1.乳腺癌耐阿霉素细胞株mcf-7/adr中膜联蛋白a5的表达从mrna到蛋白质水平均高于乳腺癌敏感株mcf-7。2.将成功合成的三条敲低序列构建到载体plko.1上。慢病毒转染后,获得稳定敲低膜联蛋白a5序列的四个细胞株:mcf-7/adr/a5-1、mcf-7/adr/a5-2、mcf-7/adr/a5-3和mcf-7/adr/si-ctr。3.荧光定量pcr和western-blot检测各组细胞膜联蛋白a5mrna和蛋白水平的表达,其中,mcf-7/adr/a5-2细胞株中膜联蛋白a5蛋白和mrna表达抑制率最高,与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。而无关序列转染组与对照组相比差异没有统计学意义(p>0.05)。因此,选用mcf-7/adr/a5-2细胞株进行下一步研究。4.MTT法分析各组细胞阿霉素敏感性的改变,发现MCF-7/ADR/A5-2细胞株对阿霉素的敏感性与对照组MCF-7/ADR细胞相比升高了近3倍,差别具有统计学意义(p<0.05),无关序列转染组MCF-7/ADR/si-CTR细胞和对照组MCF-7/ADR相比差异没有统计学意义(p>0.05)。5.流式细胞仪分析细胞膜表面P-gp蛋白表达的变化,发现MCF-7/ADR/A5-2细胞株中p-gp蛋白表达与对照组相比下降了9.11%(p<0.05)。荧光定量PCR结果显示编码P-gp蛋白的MDR1基因水平的改变没有统计学意义(p>0.05)。荧光共聚焦结果显示,罗丹明123孵育三组细胞相同时间后,MCF-7/ADR/A5-2细胞株中荧光强度显著高于对照组和无关序列转染组。6.Western-Blot结果显示,相同浓度阿霉素作用三组细胞相同时间,MCF-7/ADR/A5-2细胞株中Cleaved-PARP蛋白表达水平明显高于对照组和无关序列转染组(p<0.05),且随着阿霉素作用浓度的加大,Cleaved-PARP蛋白表达水平进一步升高。结论:1.乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR中,膜联蛋白A5的表达高于乳腺癌敏感株MCF-7。2.下调乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR中膜联蛋白A5的表达,可以增加其对阿霉素的敏感性。3.下调膜联蛋白A5提高MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性,其作用机制包括两个方面:其一,细胞膜表面P-gp蛋白的表达不仅降低,其活性也降低;其二,凋亡相关蛋白Cleaved-PARP的表达增多,促进细胞凋亡,从而促使细胞对阿霉素的敏感性增加。