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【研究背景】癌症严重威胁人类生命健康,其发病率和死亡率在全世界范围内逐年递增,且其具有恶性程度高,高复发,高转移等特点。因此,针对肿瘤发生发展机制的研究具有重要意义。大量研究表明,肿瘤发生是受多基因多因素调控的慢性进展过程。基因突变在癌症中的调控作用不仅是本领域内的新兴热点方向,更是肿瘤靶向治疗的靶点。已有研究发现原癌基因Ptpn11编码的SHP-2蛋白激活突变参与调控肿瘤的发生和维持,但其具体机制尚不明确。因此,本研究用小鼠胚胎成纤维细胞研究Ptpn11编码的SHP-2蛋白激活突变调控肿瘤发生的分子生物学机制,并寻找改善患者预后的新型靶向肿瘤标志物。SHP-2是一种普遍存在的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）,该PTP包括两个串联Src同源结构域（N-SH2和C-SH2）,它们起磷酸酪氨酸结合域的作用,并介导该PTP与底物相互作用,在多种信号转导途径中发挥着至关重要的作用。SHP-2的功能失调能够诱发Noonan综合征、白血病、肺癌等。我们课题组前期研究发现,SHP-2激活突变不仅增强细胞扩散及血管生成,而且能够调节肿瘤发展中起重要作用的RAS-RAF等信号异常活化;还发现其突变增加了小鼠结直肠癌的发生。micro RNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA（约22个核苷酸）,它与其靶基因3’-UTR区结合,降解靶mRNA或抑制其翻译,参与基因转录后调控,从而在许多人类癌症中异常表达并发挥作用。我们前期在砷诱导的SHP-2 D61G功能性突变的小鼠胚胎成纤维细胞中做基因芯片检测多种miRNA表达谱发现miR-100的表达显著下降。研究发现miR-100参与调控多种细胞过程,在许多恶性肿瘤中异常表达并发挥作用。基于此,我们假设Ptpn11E76K激活突变协同miR-100失活促进细胞的恶性转化,本研究拟采用建立原代小鼠胚胎成纤维细胞作为体外研究肿瘤发生模型,明确Ptpn11E76K激活突变协同miR-100失活促进细胞的恶性转化的分子机制。建立的原代细胞系培养传代过程中,细胞形态和增殖能力发生改变,原代野生型MEF细胞会发生衰老,而Ptpn11E76K突变和miR-100失活的基因型MEF细胞会越过衰老而自发永生化。因此,本课题主要研究Ptpn11E76K激活突变协同miR-100失活对MEF细胞恶性生物学行为的影响及其肿瘤的发生。【研究方法】1. 取13.5d不同基因型的孕鼠制备原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）,通过相应胚胎组织的基因型鉴定后得到所需的MEFs并且纯化。2. 用表达Cre重组酶的腺病毒（Ad-Cre-GFP）同时感染制备的四组MEF细胞。在Cre重组酶作用下,能够将E76K前面的neo基因盒子敲除,从而表达E76K;并且Cre重组酶还可以利用识别loxp位点切除miR-100,实现miR-100功能失活。因此得到Ptpn11E76K突变和miR-100失活的MEF细胞株,进一步通过荧光定量PCR检测各组细胞中Cre,SHP-2,miR-100的表达情况来验证转染效率。3.衰老相关β-半乳糖苷酶染色和相关细胞行为学实验检测Ptpn11E76K激活突变和miR-100失活对MEF细胞的生物学行为的影响:a.增殖实验:MTT,Ki67的免疫荧光和流氏细胞术,细胞周期分析b.细胞集落生长能力:平板克隆c.细胞非锚定生长情况:软琼脂集落形成d.迁移和侵袭能力:Transwell实验,划痕实验4.体内实验,建立裸鼠移植瘤模型检测四组MEF细胞在裸鼠体内增殖情况并将移植瘤接种在C57/BL6小鼠皮下进行传代培养。【实验研究结果】1.制备培养的原代小鼠胚胎成纤维细胞形态为纺锤形,细胞胞体宽大并有分支,胞核呈椭圆形,细胞活力良好。2.成功感染并构建了miR-100-/-Ptpn11E76K/+,Ptpn11E76K/+,miR-100-/-和WT（+/+）的四组MEF细胞株,并检测到miR-100-/-Ptpn11E76K/+,Ptpn11E76K/+MEF细胞中neo盒mRNA表达水平几乎为零,以及这两组细胞中SHP-2 mRNA水平恢复到与WT（+/+）MEF细胞SHP-2 mRNA水平相当;miR-100-/-Ptpn11E76K/+和miR-100-/-两组MEF细胞中miR-100 mRNA表达水平几乎为零。3. WT细胞P10出现衰老,胞体扁平增大,生长停滞且β-Gal染色呈蓝色。而miR-100-/-Ptpn11E76K/+MEF细胞无限增殖,并且细胞形态发生明显改变。4. Ptpn11E76K激活突变协同miR-100失活MEF细胞的增殖、克隆集落形成能力、迁移和侵袭能力均明显提高。5. Ptpn11E76K激活突变和miR-100失活促进MEF细胞端粒酶活性增加,细胞越过衰老期获得自发永生化细胞系。6. Ptpn11E76K激活突变和miR-100失活促进裸鼠皮下成瘤并连续传代的能力,HE病理分析肿瘤为粘液性纤维母细胞肉瘤,小鼠各器官外观无明显差异。【结论】Ptpn11E76K激活突变和miR-100失活促进原代小鼠胚胎成纤维细胞的恶性转化