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植酸及其盐类是植物性食品和饲料中磷的主要贮存形式，植酸酶是催化植酸及其盐类水解成低磷酸化的肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。在饲料中添加植酸酶不但可以提高动物对磷的吸收，降低环境中磷的污染，而且能解除植酸对金属离子、氨基酸的鳌合作用，大大提高饲料的利用效率，在国内外饲料工业中有着广泛的应用前景。多种微生物如细菌、丝状真菌、酵母等都能产生植酸酶，但由于天然菌株产酶量较低，而且植酸酶的热稳定性问题一直不能得到很好的解决，所以目前植酸酶在饲料中并没有得到广泛的推广和应用。利用基因工程技术生产植酸酶，不仅可以大幅度提高其产量，还能按照人们的需要改变蛋白的特性，获得具有优良特性的高活性植酸酶蛋白。本研究根据已发表的植酸酶基因全序列设计2对引物，用PCR方法从黑曲霉WP1总DNA中扩增到约1.4kb和1.5kb的phyA和phyB基因片段，对2个基因片段进行了克隆及序列测定。测序结果表明：phyA1基因长1347bp，共编码448个氨基酸，有11个潜在的N-糖基化位点，含有植酸酶活性位点“RHGXRYP”和“HD”，该基因已在GenBank注册，注册号为：DQ815852。phyA1基因与产植酸酶酶活最高的天然黑曲霉标准菌株NRRL3135（Accession：M94550）氨基酸序列比较，同源性达97.77％，因此命名为phyA1。phyB1基因长1560bp，含有3段内含子，共编码460个氨基酸，含有植酸酶保守序列“RHGXRXP”和“HD”，与已报导的ALKO243的植酸酶aph基因（GenBank Accession：L02420）相比较，编码的氨基酸序列同源性为99.13％，因此将其命名为phyB1。该基因黑曲霉WP1植酸酶phyB1基因序列已在GenBank中注册，注册号为：DQ836360。将植酸酶phyA1基因与穿梭质粒pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K／phyA1，将该质粒用电转法转化至毕赤酵母GS115，并用MM、MD、G418、植酸钙平板筛选转化子，结果得到一株转化子GA-22，在甲醇的诱导下，该植酸酶phyA1基因在毕赤酵母中得到了表达，甲醇诱导144h后，培养上清中植酸酶活性达64510U／mL，比出发菌株酶活（42U／mL）提高了1535倍。经SDS-PAGE凝胶电泳分析，该重组蛋白的分子量为66kD。酶学性质检测发现，重组植酸酶的最适作用温度为50℃，最适作用pH值为5.5，Km值为0.072 mmol／L，重组植酸酶在50℃，60℃条件下处理20min后，该酶的相对酶活力分别为67.8％，57.2％；50℃处理40 min后，酶活力仍在50％以上；而将植酸酶于70℃处理5min后，残余酶活力已下降至40％左右，处理80min，酶活几乎丧失。金属离子对植酸酶活性存在不同程度的影响。在我国关于植酸酶phyB的研究较少，从同一菌株上克隆出2种植酸酶基因，在国内未见报道。phyB1基因的克隆成功，为植酸酶的深入研究提供了实验材料。植酸酶GS115-pPIC9K-phyA1基因工程菌的构建，为实现生物反应器大量、高效生产植酸酶提供了优良的菌种。同时开展Pichia pastoris-phyA表达的研究，将为今后研究和开发多功能微生态制剂，实现畜牧业综合化、环保化发展等应用研究奠定坚实的基础。