ABL-N对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

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肺癌是2008年全球男性诊断率和死亡率最高的癌症,女性肺癌的诊断率和死亡率分别占第四位和第二位。2008年全年总诊断率13%(160万),总死亡率18%(140万),对人类健康造成严重威胁。尽管手术治疗和化学治疗技术不断发展,但肺癌患者生存率却没有明显改变。中草药在临床研究中对一些肿瘤的预防和治疗作用,已经引起足够重视。从中药中提取分离得到的抗肿瘤成分,包括紫杉醇、喜树碱和长春碱类等,已成为临床治疗肿瘤的常用药物。研究发现,从菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花(Inula britannica. L.)中提取的倍半萜内酯1-O-乙酰基大花旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone, ABL)有抗肿瘤作用。本文所用为ABL的衍生物5-(5-(ethylperoxy)pentan-2-yl)-6-methyl-3-methylene-2-oxo-2, 3, 3a, 4, 7, 7a-hexahydrobenzofuran-4-yl2-(6-methoxynaphthalen-2-yl) propanoate (ABL-N)。目的:观察ABL-N对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,初步研究其作用机制。方法:1不同终浓度ABL-N培养Lewis肺癌细胞12、24和48 h,MTT比色法检测细胞增殖抑制率和计算IC50值。2 ABL-N干预后Lewis肺癌细胞凋亡的形态学变化(1)倒置显微镜观察对照组细胞和10μg/mL ABL-N处理组细胞培养48 h后的生长情况。(2)Hoechst 33258荧光染色:荧光显微镜观察对照组细胞和10μg/mL ABL-N处理组细胞培养48 h后细胞核的变化。3 DNA裂解片段凝胶电泳:不同终浓度ABL-N处理组Lewis肺癌细胞培养24、48和72 h后,抽提细胞DNA,进行DNA裂解片段凝胶电泳。4流式细胞仪检测ABL-N干预后Lewis肺癌细胞凋亡率及细胞周期改变。不同终浓度ABL-N培养Lewis肺癌细胞48 h后,经过PI染色,流式细胞仪定量检测不同浓度组的细胞凋亡率,并分析细胞周期改变。5 Western blot检测不同浓度药物干预细胞48 h后细胞中Bax、Bcl-2、p53蛋白的表达情况。结果:1不同终浓度(2.5、5、10、20μg/mL)ABL-N培养Lewis肺癌细胞,12小时抑制率为7.6%,8.9%,16.5%和73.4%,IC50为14.0μg/mL;24小时抑制率17.7%,25.6%,60.3%和89.2%,IC50为7.3μg/mL;48小时抑制率15.3%,29.9%,89.9%和94.2%,IC50为5.7μg/mL。2利用倒置显微镜观察10μg/mL ABL-N处理48 h后细胞的形态,表现为细胞体积减小,细胞间隙增大。荧光显微镜观察10μg/mL ABL-N处理组细胞培养48 h后细胞核的变化,处理组细胞染色质聚集、固缩或断裂,有凋亡小体生成。3 DNA裂解片段凝胶电泳分析:ABL-N对DNA的裂解呈时间-剂量依赖性。不同终浓度(5、10、20μg/mL)ABL-N处理组48 h与72 h均出现梯状带,是典型的凋亡生化特征。4流式细胞仪检测:不同终浓度(10、20μg/mL)ABL-N培养Lewis肺癌细胞48 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为21.2%和50.9%,且凋亡图中可见明显的凋亡小峰,即Sub-G1期细胞。细胞周期阻滞在G1期。5 Western blot结果显示ABL-N能够下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax、p53蛋白的表达。结论:1 ABL-N能抑制Lewis肺癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡,其作用呈时间和浓度依赖性,同时伴随G1期细胞周期阻滞。2 ABL-N诱导凋亡的作用可能与下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax、p53蛋白的表达有关。
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