论文部分内容阅读
目的在本研究小组的前期研究证实实验性癫痫诱发前予以经皮三叉神经电刺激预处理可能通过增高谷氨酸脱羧酶（GAD）而起到抗癫痫作用的基础上。本实验中我们通过观察经皮三叉神经电刺激（TNS）处理对匹罗卡品诱发的癫痫大鼠海马区细胞因子IL-1β和TNF-α的表达、小胶质细胞的活化、癫痫大鼠的癫痫行为以及空间学习记忆能力的改变，以期探讨经皮三叉神经电刺激对实验性癫痫的治疗作用、可能炎性机制及经皮三叉神经电刺激对实验性癫痫大鼠学习记忆能力的影响。方法本实验分为两部分：第一部分：选择清洁健康雄性SD大鼠120只，随机分成正常对照组（control组）30只和实验组（experiment组）90只。给予实验组大鼠皮下注射匹罗卡品以建立癫痫持续状态（SE）模型，同时给予对照组大鼠皮下注射同等计量的生理盐水。6h后将实验组大鼠随机分成单纯匹罗卡品模型组（pilo组）和经皮三叉神经电刺激组（TNS组）各45只，分别给予假刺激和电刺激处理。4周后再次给予pilo组和TNS组进行匹罗卡品致痫。用酶联免疫吸附（Elisa）的方法检测三组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α的蛋白含量；免疫组化的方法观察小胶质细胞活化情况。第二部分：选择清洁健康雄性SD大鼠30只，同样随机分成正常对照组（control组）、单纯匹罗卡品组（pilo组）和经皮三叉神经电刺激组（TNS组）各10只。给予pilo组和TNS组大鼠皮下注射匹罗卡品以建立SE模型，同时给予对照组大鼠皮下注射同等计量的生理盐水。然后分别给予pilo组和TNS组连续4周假刺激和TNS处理。同时，SE模型建立2周后，视频监测三组大鼠自发性发作（SRS）的频率以及每次发作的持续时间，每天监测6小时，连续监测两周。电刺激处理4周完成后，各组大鼠进行Morris水迷宫实验以检测其空间学习记忆能力。结果第一部分：1. pilo组和TNS组实验大鼠再次匹罗卡品致痫后，TNS组大鼠较pilo组痫性发作严重程度减轻，持续时间较短,死亡率降低（P<0.05，p<0.01）；实验大鼠SE后，分别给予pilo组和TNS组连续4周的假刺激和TNS处理，之后再次匹罗卡品致痫，结果pilo组5只大鼠(SRM=1.39>1)、TNS组2只大鼠在发作中死亡(SRM=0.59<1)，差异有统计学意义。再次匹罗卡品致痫后TNS组大鼠痫性发作程度较pilo组轻，且持续时间较短（TNS组平均分为1.8±0.4分，持续时间13.2±5.2min,pilo组平均分为3.5±0.9分，持续时间16.4±5.8min），差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。2.各时间点TNS组大鼠海马IL-1β和TNF-α含量分别相应较pilo组显著降低（P<0.05，p<0.01）;正常对照组大鼠海马IL-1β、TNF-α蛋白含量甚微。pilo组和TNS组实验大鼠SE后24h均即可检测出海马中含量显著升高IL-1β和TNF-α，72h节点达高峰，至癫痫发作后28天，虽含量降低，但仍可检测出较正常对照组显著增高（P<0.05，P<0.01）。TNS组的IL-1β和TNF-α含量变化走势与Pilo组基本一致。在癫痫发作后的24h、48h、72h、7d、14d及28d节点，TNS组大鼠海马IL-1β和TNF-α含量虽较正常对照组均显著增高，但较pilo组均显著减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。3. TNS组活性小胶质细胞在各时间点的数量分别相应较pilo组均明显减少（P<0.05，p<0.01）;对照组大鼠海马区Iba1（小胶质细胞标志物）阳性细胞表达较少，胞体呈圆形或椭圆形，突起较少。pilo组和TNS组Iba1阳性细胞着色较深，部分细胞胞体演变成狭长状及梭状，突起增多、增粗，以致痫后第3天最为明显。pilo组随癫痫发作后各时间点的延长，呈快速增加趋势(P﹤0.01)，TNS组的变化趋势与pilo组相一致。与pilo组比较，TNS组活化的小胶质细胞的数量在各时间点均明显减少（P<0.05，P﹤0.01）。第二部分：1. TNS处理减少了SRS发生的频率、降低了发作严重程度并缩短了发作时间（P<0.05，p<0.01）；当建立SE模型并刺激处理2周后，开始视频监测三组实验大鼠的SRS。结果发现正常对照组大鼠在整个实验过程中均未见任何异常行为；TNS组大鼠SRS发作频率显著少于pilo组大鼠（TNS组发作频率为1.4±0.3次/24h，Pilo组发作频率为3.8±0.6次/24h）、每次发作持续时间显著缩短（TNS组SRS平均持续时间为15±6min，Pilo组大鼠SRS平均持续时间为35±12min）、癫痫发作级别较低（TNS组平均分为1.8±0.2分，pilo平均分为3.2±0.3分）（P<0.05或P<0.01）。2.TNS处理缩短了大鼠水迷宫试验逃避潜伏期，提高大鼠在目标象限的航行时间百分比（P<0.05，p<0.01）；在大鼠水迷宫获得性训练试验中，随着训练次数的增加，各组实验动物寻找水下平台的时间逐渐缩短，在平台象限搜索的时间和航行的距离也有所改变。获得性训练的1d,2d,3d,4d和5d,pilo组大鼠平均逃避潜伏期较正常对照组均显著延长（P<0.01），而各时间点TNS组大鼠平均逃避潜伏期却较pilo组大鼠显著缩短（P<0.05，P<0.01）。在第6天的空间探索试验中，pilo组大鼠较正常对照组试验大鼠60s内在目标象限搜索的时间百分比、航行距离百分比及穿越平台的次数均显著降低（P<0.01），TNS组实验大鼠60s内在目标象限搜索的时间百分比及航行距离百分比与pilo组相比显著较高（P<0.05），穿越平台的次数较pilo组多（P<0.01）。结论建立匹罗卡品癫痫模型后，经皮电刺激其三叉神经的眼支，可有效减轻匹罗卡品致痫后自发性发作、有效降低大鼠海马区IL-1β和TNF-α含量、抑制小胶质细胞活化并显著改善癫痫大鼠受损的空间学习记忆能力。结合以往的研究结果提示TNS通过提高了癫痫发作的阈值发挥显著的抗癫痫作用，其机制可能与其下调炎性因子IL-1β和TNF-α及减轻小胶质细胞的活化有关。本实验结果为癫痫机理探索及癫痫临床治疗手段选择提供借鉴作用。