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水是植物生命活动的物质基础,干旱对植物有广泛的影响。在干旱胁迫条件下,植物新陈代谢发生变化,生理活动受到阻碍,生长发育各阶段受到影响,植物出现萎蔫现象。垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim),俗称“九死还魂草”,极耐干旱。它能经受脱水与再水化的循环,一旦获得水分,植物枯黄卷缩的部分可以迅速张开,重新复活。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物—海藻糖。海藻糖对生物体有特殊保护作用,它能使许多生物在高温、脱水和冷冻等异常条件下仍保持原活性。以UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成途径广泛存在于细菌、真菌和植物体内,其中由TPS1基因编码的海藻糖-6-磷酸合成酶是合成途径的关键酶。研究人员已在植物体内克隆出了TPS1基因,但除了在复苏植物体内检测到大量海藻糖积累外,在其他植物体内没有检测到海藻糖的存在。国内外已有将酵母和大肠杆菌的TPS1基因对植物体进行遗传转化研究,转化植株体内海藻糖含量有所增加,抗旱性得到增强,但植株在生长发育和形态上有不同程度的改变。探索利用耐旱能力高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因,是转基因耐旱玉米培育的技术关键。本研究选择了极耐旱的垫状卷柏做为试验材料,采用RACE技术克隆海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1),全长3223 bp,包含一个2790bp的完整开放阅读框(ORF),并对SpTPS1基因进行核酸序列和成熟蛋白生物信息学的初步分析。为了研究垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1)的功能,将SpTPS1基因的开放阅读框ORF亚克隆到载体pUC119中,构建载体OpUC119。然后选择适当的酶切位点分别酶切载体OpUC119和质粒载体pRS6/AtTPS1,将ORF片段与质粒载体骨架pRS6相连,最终得到真核表达载体OpRS6。用LiAc转化法将真核表达载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1转入缺失酵母菌株tps1△,YSH290中,转化混合液涂在缺失组氨酸的半乳糖培养基上培养。结果显示野生型菌株W303-1A和缺失酵母菌株tps1△不能在培养基上生长;转化了载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1的菌株能在缺失组氨酸的半乳糖培养基上生长。将培养基中的2%半乳糖换为2%葡萄糖,挑选阳性转化子划线于该培养基中。结果显示野生型菌株W303-1A和缺失酵母菌株tps1△不能在缺失组氨酸的葡萄糖培养基上生长;转化了载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1的菌株tps1△,由于恢复了功能,故能在含有葡萄糖的培养基上生长。提取阳性菌株质粒DNA,经PCR检测正确。通过酵母功能互补试验证明了SpTPS1基因具有编码海藻糖-6-磷酸合成酶的功能。本研究从垫状卷柏中克隆了具有抗旱耐盐的SpTPS1基因,它作为培育抗旱耐盐新品种的抗旱基因,具有广泛的应用价值。并为后续的抗旱耐盐转基因新品种的培育提供了耐旱能力更高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因。