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背景:脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是神经内科常见的急危重症,发病后死亡率和致残率极高,给社会和家庭造成了沉重的负担。然而近二十年来无论外科手术还是内科治疗均未能取得明显进展。中医药治疗急性出血性中风历史悠久,积有丰富临床经验;因其多层次、多靶点作用,日渐成为新的研究热点。生地大黄汤(Rehmannia and Rhubarb Decoction,RRD)首见于唐代孙思邈《千金翼方》卷十八,药用生地黄、生大黄,可清热滋阴、止血活血;善治各种出血性疾病,临床疗效明确。血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)作为中枢神经系统的重要防线,脑出血后首当其冲。基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)已被阐明是引起血脑屏障损伤的重要分子,明确其上游调控机制具有重要意义。前期实验基础发现生地大黄汤治疗急性脑出血大鼠时能够下调MMP9表达,但其确切作用机制尚不明确。本实验中,采用自体血注入法制备脑出血大鼠模型,分组干预后,评价各组神经功能缺损、血脑屏障结构和功能、相关蛋白表达;并进一步运用HMGB1诱导星形胶质细胞体外模型,分组干预后,评价各组相关蛋白及mRNA表达、MMP9活性;以明确HMGB1/TLR4/MMP9信号通路在急性脑出血大鼠血脑屏障损伤中的作用及生地大黄汤的干预保护机制,为脑出血疾病的治疗提供理论依据。第一部分HMGB1/TLR4/MMP9信号通路在急性脑出血大鼠血脑屏障损伤中的作用研究目的:观察HMGB1/TLR4/MMP9信号通路在急性脑出血大鼠血脑屏障损伤中的作用。方法:68只自发性高血压大鼠随机分为假手术组、模型组、TLR4拮抗剂TAK-242组、HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)组,每组17只。假手术组只进针不注血,另3组按自体血注入法建立大鼠脑出血模型。TLR4拮抗剂TAK-242腹腔注射给药3mg/kg/d,HMGB1抑制剂EP腹腔注射给药80mg/kg/d。连续干预3天后取材。各组大鼠进行神经功能缺损评分;电镜、免疫荧光染色观察血脑屏障结构;脑含水量检测、伊文思蓝法观察血脑屏障功能;Western blot检测脑血肿周围HMGB1、TLR4、MMP9蛋白分子的表达。结果:(1)神经功能缺损:与假手术组比较,模型各组神经功能缺损评分升高(P<0.05);TAK-242组、EP组较模型组降低(P<0.05)。(2)血脑屏障结构:与假手术组比较,模型各组血脑屏障结构电镜下显示破坏明显;免疫荧光染色见紧密连接蛋白Claudin-5、星形胶质细胞表达减少;TAK-242组、EP组较模型组血脑屏障结构电镜下显示破坏有不同程度缓解,免疫荧光染色见Claudin-5、星形胶质细胞表达有一定程度的升高。(3)血脑屏障功能:与假手术组比较,模型各组脑含水量、血脑屏障通透性均升高;TAK-242组、EP组较模型组降低(P<0.05)。(4)蛋白表达:与假手术组比较,模型各组脑血肿周围组织HMGB1、TLR4、MMP-9蛋白表达升高;TAK-242组、EP组较模型组降低(P<0.05)。结论:大鼠急性脑出血时,血脑屏障结构和功能均遭到破坏,其可能机制与HMGB1/TLR4/MMP-9信号通路表达相关。第二部分生地大黄汤干预HMGB1/TLR4/MMP9信号通路保护急性脑出血大鼠血脑屏障的机制研究目的:观察生地大黄汤干预HMGB1/TLR4/MMP9信号通路对急性脑出血大鼠血脑屏障的保护作用。方法:100只自发性高血压大鼠随机分为假手术组、模型组、生地大黄汤(RRD)组、TLR4拮抗剂+生地大黄汤(TAK-242+RRD)组、HMGB1抑制剂+生地大黄汤(EP+RRD)组,每组20只。假手术组只进针不注血,另4组按自体血注入法建立脑出血大鼠模型。TAK-242、EP给药方式同前,生地大黄汤灌胃给药18.5g/kg/d,假手术组、模型组灌胃等体积纯水。连续干预3天后取材。各组大鼠进行神经功能缺损评分;电镜、免疫荧光染色观察血脑屏障结构;脑含水量检测、伊文思蓝法、MRI检测观察血脑屏障功能;TUNEL染色、Nissl染色观察脑血肿周围组织病理变化;Western blot检测脑血肿周围组织HMGB1、TLR4、MMP9蛋白及紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1的表达。结果:(1)神经功能缺损:与假手术组比较,模型各组神经功能缺损评分升高(P<0.05);RRD组、TAK-242+RRD组、EP+RRD组较模型组降低(P<0.05)。(2)血脑屏障结构:与假手术组比较,模型各组血脑屏障结构电镜下显示破坏明显;免疫荧光染色见紧密连接蛋白Claudin-5、星形胶质细胞表达减少;RRD组、TAK-242+RRD组、EP+RRD组较模型组血脑屏障结构电镜下显示破坏均有不同程度缓解,免疫荧光染色见紧密连接蛋白Claudin-5、星形胶质细胞表达均有一定程度的升高。(3)血脑屏障功能:与假手术组比较,模型各组脑含水量、血脑屏障通透性、脑水肿体积均升高;RRD组、TAK-242+RRD组、EP+RRD组较模型组降低(P<0.05)。(4)病理变化:与假手术组比较,模型各组脑血肿周围组织细胞凋亡增多、尼氏体减少(P<0.05);RRD组、TAK-242+RRD组、EP+RRD组较模型组细胞凋亡减少、尼氏体增多(P<0.05)。(5)蛋白表达:与假手术组比较,模型各组脑血肿周围组织HMGB1、TLR4、MMP9蛋白表达升高,紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1表达降低;RRD组、TAK-242+RRD组、EP+RRD组较模型组HMGB1、TLR4、MMP9蛋白表达减少,紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1表达增多(P<0.05)。结论:生地大黄汤能够保护脑出血大鼠血脑屏障,改善血脑屏障结构和功能的破坏,机制可能与其下调HMGB1/TLR4/MMP9信号通路保护血脑屏障相关。第三部分生地大黄汤对星形胶质细胞HMGB1/TLR4/MMP9信号通路干预机制研究目的:观察生地大黄汤对星形胶质细胞HMGB1/TLR4/MMP9信号通路的影响。方法:运用HMGB1诱导星型胶质细胞模型,模型建立后随机分为空白对照组、HMGB1模型组、RRD组、TLR4拮抗剂组、TLR4拮抗剂+RRD组。药物共培养6小时后,Western blot检测TLR4、MMP9蛋白表达,RT-PCR检测TLR4、MMP9mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP9活性。结果:(1)蛋白表达:与空白对照组比较,模型各组TLR4、MMP9蛋白表达上调,RRD组、TLR4拮抗剂组较模型组TLR4、MMP9蛋白表达受一定程度抑制。(2)mRNA表达:与空白对照组比较,模型组TLR4、MMP9 mRNA表达明显上调(P<0.05),RRD组、TAK-242组、TAK-242+RRD组较模型组TLR4、MMP9mRNA表达明显减少(P<0.05)。(3)MMP9活性:与空白对照组比较,模型各组MMP9活性升高(P<0.05);RRD组、TLR4拮抗剂组、TLR4拮抗剂+RRD组较模型组MMP9活性明显受抑制(P<0.05)。结论:生地大黄汤能够明显降低HMGB1诱导的星形胶质细胞MMP9活性,机制可能与其下调TLR4、MMP9 mRNA表达相关。