论文部分内容阅读
睡莲(waterlily)是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)的多年生水生草本植物,其花和叶均具观赏性。根据其生态特性可分为:热带睡莲和耐寒睡莲。睡莲的花色丰富,近年来对睡莲花色的研究主要是花瓣中色素成分分析,而呈色的分子机理研究甚少,本研究通过从转录组中筛选出来的与类黄酮途径相关的MYB转录因子的研究,以期解析睡莲花色形成过程中转录因子的作用机制。本实验利用高通量测序技术,首先构建了蓝色系热带睡莲‘泰国王’(Nymphaea’King of Siam’)和‘特里顿’(Nymphaea’Teri Dunn’)、粉色系热带睡莲‘鲁比’(Nymphaea’Ruby,)、粉色系耐寒睡莲‘粉日出’(Nymphaea ’Pink Sunrise’)这四个睡莲品种花瓣的cDNA文库,通过转录组测序分别得到483,278,08、440,326,56、444,356,74、456,391,24 条 clean reads,经过组装后共得到 276,644 条 unigenes,unigenes的平均长度是612.15 nt,获得有注释信息的Unigenes有126,065条。通过差异表达分析发现,粉色系的耐寒睡莲‘粉日出’与热带睡莲之间的差异表达基因最多:热带睡莲不同品种间的差异表达基因相对较少。88%的被子植物花色的形成与类黄酮化合物有关,花青素苷是类黄酮化合物中尤为重要的一种,不同种类的花青素苷是植物呈现蓝色、紫色、红色、粉色的决定性原因。本研究对睡莲花瓣转录组中差异表达的unigenes进行KEGG的富集分析,发现参与类黄酮生物合成的差异表达unigenes有410个,其中与类黄酮途径中的黄酮、黄酮醇生物合成相关的差异表达基因有197个。类黄酮生物合成途径在四个品种两两比较中均显著富集,表明睡莲花瓣中类黄酮生物合成活跃。多重比较后,从差异表达基因中发现了 214个MYB转录因子,其中有51个与植物体内的花青素以及原花青素合成相关,这51个MYB转录因子中有30个是R2R3型MYB。通过对睡莲花瓣转录组中转录因子的深入挖掘,得到了一个R2R3型MYB转录因子,命名为MYB6,该转录因子在四个睡莲品种中存在差异表达情况,且通过B LA S TX比对上的相似度最高的基因的功能已经被验证,所以展开对该基因的研究,主要实验内容如下:(1)以‘泰国王’花瓣为实验材料,提取总RNA,利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到了MYB6基因的cDNA全长,然后构建植物表达载体pSN1301-MYB6,采用农杆菌介导法转化烟草,通过鉴定后获得了 20株阳性转基因烟草。(2)通过qRT-PCR筛选出MYB6基因表达量相对较高的5个株系,分别是:#20、#19、#12、#9、#14(根据MYB6基因表达量从高到低排列):再通过qRT-PCR检测这5个株系的烟草花瓣类黄酮生物合成途径中相关基因的表达情况,结果发现(与对照相比):PAL基因的表达量都有所降低,且差异显著;4CL基因表达量在株系#9、#12、#14、#19中均降低,在#20中升高;CHS基因在5个株系中均降低;CHI基因表达量在#9、#12、#14中显著降低,在#19中有所降低,在#20中无明显变化:F3H基因表达量在株系#9、#14、#19中明显降低,在#12中有所降低,在#20中明显升高;F3’H基因表达量在#9、#12中显著降低,在#14、#19中极显著降低,在#20中极显著升高:DFR基因表达量在株系#14、#19中极显著降低,在其他三个株系中明显升高;FLS基因表达量在#9、#14中显著降低,在其他三个株系中明显升高;ANS基因在#9、#14、#19中均显著降低,在#12中明显降低,在#20中明显升高。(3)经花色表型鉴定发现,与对照组的烟草相比较,转MYB6基因的烟草花瓣颜色变浅:通过CIEL*a*b*表色系统测量发现,转基因烟草花瓣的色相a*值明显要低于对照组,与观察到的转MYB6基因的烟草花瓣红色比对照浅相符。(4)通过高效液相色谱(HPLC)的方法检测发现,转MYB6基因的烟草花瓣花青苷含量比对照有所下降,株系#12和株系#14与对照相比极显著降低,其他株系无明显变化;黄酮和黄酮醇含量变化不大。综上所述,MYB6基因在转基因烟草花瓣中起一定的负调控作用,对上游基因中的PAL有特异调控作用。耐寒睡莲中缺少热带睡莲所拥有的蓝色和蓝紫色系的品种,花色的形成受到一系列关键酶基因的催化,而这些酶基因的功能又受到许多转录因子的调控。本研究通过分析不同花色的睡莲花瓣转录组数据,从中筛选与花色形成相关的MYB转录因子并进行功能研究,以期为解析睡莲花色形成过程中转录因子的作用机制奠定理论基础。