燕麦孢囊线虫候选效应因子对植物防御反应的影响

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燕麦孢囊线虫(cereal cyst nematode,CCN)Heterodera avenae是一类固着型植物内寄生线虫,分布广泛且危害严重,是世界范围内禾谷类作物的重要病原之一。越来越多的证据表明:植物寄生线虫可以通过分泌一系列效应因子到植物细胞中促进寄生,而植物也会启动防御反应来抵御线虫的寄生。本论文着眼于燕麦孢囊线虫效应因子对植物防御反应的影响以探索其与寄主的互作过程。采用烟草瞬时表达系统,共鉴定了 51个Havenae候选寄生基因对植物防御反应的影响,结果发现大部分基因均具有抑制BAX触发的烟草细胞程序性死亡(BT-PCD)的功能,即具有抑制植物防御反应的功能。其中41个基因可以抑制BT-PCD,占基因总数的80%;3个不抑制,占6%。此外,还发现7个基因本身能够激发烟草防御反应,产生叶片坏死、变色等表型,占14%。随后,选取其中抑制BT-PCD的类膜联蛋白基因Ha-annexin进行深入功能分析。经预测该基因编码一个326个氨基酸的蛋白,与Globoderapallida的分泌蛋白annexin 2相似度最高;Southern杂交结果显示Havenae基因组中至少存在两个annexin拷贝;线虫组织原位杂交结果显示该基因表达于亚腹食道腺细胞,且实时荧光定量PCR分析结果表明Ha-annexin在寄生期二龄时期表达量较高,表明该基因可能编码一个在寄生前期起主要作用的分泌蛋白。采用大麦条纹花叶病毒BSMV介导的寄主引发的基因沉默(BSMV-HIGS)体系,体内沉默该基因后,H.avenae 7 dpi和40 dpi时的侵染数目显著降低,说明该基因对H.avene 的寄生(至少是前期寄生)过程具有重要作用。洋葱细胞和烟草细胞亚细胞定位结果均显示Ha-ANNEXIN表达于细胞膜和细胞质中。进一步分析表明,Ha-annexin可抑制PAMP触发的免疫(PTI)通路上的三个标示基因(NbPti5,NbAcre31和NbGras2)的表达,说明该基因可以抑制植物的PTI免疫反应。并且,研究发现该基因的作用靶标位于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径信号通路的两个激酶MKK1和NPK1的下游反应。另外,由于小麦基因组较大且复杂,开展分子生物学和遗传学研究难度较大,为了方便H.avenae基因功能的研究,本论文鉴定了禾本科模式植物二穗短柄草Brachypodium distachyon作为H avenae的模式替代寄主的可行性。对25个B.distachyon 品系接种北京大兴H.avenae后发现,H.avenae可在一半的B.distachyon品系上完成生活史。侵染症状与小麦类似,整个根系变小,且须根呈现变短变粗的特点。随后,进一步优化了 H.avenae对B.distacyon的侵染条件。其中品系Koz-1的平均单株孢囊量较多,作为替代寄主较合适,且接种江苏南京、河北保定、河北滦南、北京大兴和河南荥阳等5个地理种群的CCN(Hal或Ha3致病型组)均能形成孢囊,显示了 Koz-1品系对多个CCN种群的广泛适用性。接种不同浓度梯度线虫发现,1000 J2s/株已经达到接种量上限。
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